三氧化二砷與順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)人卵巢癌HO8910細(xì)胞凋亡的初步研究

高洪泉 張愛清 田忠富

·論著·

三氧化二砷與順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)人卵巢癌HO8910細(xì)胞凋亡的初步研究

高洪泉 張愛清 田忠富

目的探討三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對(duì)體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡影響。方法用三氧化二砷與順鉑聯(lián)合處理HO8910 細(xì)胞，采用MTT法檢測藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA降解，以及應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞周期的變化。結(jié)果在三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用下，HO8910 細(xì)胞呈凋亡改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳呈典型的凋亡特征。細(xì)胞凋亡的同時(shí)，細(xì)胞周期發(fā)生特定的改變。結(jié)論三氧化二砷與順鉑聯(lián)合能抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

三氧化二砷(As2O3)；順鉑(DDP)； 細(xì)胞凋亡；卵巢癌細(xì)胞株

卵巢癌是是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。眾多研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞分化異常增殖過度有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗癌效應(yīng)的。因此探索藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，將成為腫瘤治療的新方向。本文探討三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對(duì)體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞凋亡的作用[2]。

1 材料和方法

1.1材料及儀器 人卵巢癌細(xì)胞系HO8910購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。三氧化二砷購自哈醫(yī)大第一附屬醫(yī)院，順鉑購于錦州制藥一廠。RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Promega公司生產(chǎn)。使用前加小牛血清至10%，青霉素，鏈霉素至100 U/ml。流式細(xì)胞儀(FCM)為美國Coulter公司生產(chǎn)。碘化丙啶(PI)為美國Sigma公司生產(chǎn)。酶聯(lián)免疫檢測儀為美國Bio-TEK(型號(hào)EL-312E)產(chǎn)品。主要試劑為： EDTA[150 mmol NaCl加25 mmol 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)]；TBE緩沖液(89 mmol Tris 加 80 mmol硼酸，再加2.5 mmol EDTA)；1.5%瓊脂糖凝膠(TBE緩沖液 100 ml加入 2g 瓊脂糖加熱融化)及10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(10 g SDS加水至100 ml)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞HO8910培養(yǎng)于含有10%小牛血清，100U/ml青霉素、鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2MTT試驗(yàn) 藥物組為DDP濃度為4 μmol/L，As2O3濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L共4組，用培養(yǎng)液稀釋，卵巢癌細(xì)胞以103/ml接種于4塊進(jìn)口96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)液，每天用一塊。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，接種后24 h更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入各濃度藥物培養(yǎng)液，對(duì)照不加藥，空白對(duì)照不加培養(yǎng)液，加藥后分別于24、48、72、96 h加入20 μlMTT，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育4 h后吸出培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO震蕩溶解10 min，空白對(duì)照調(diào)零，酶聯(lián)儀檢測，波長490 nm，測定各孔的吸光值。計(jì)算抑制率，抑制率=[(陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/陰性對(duì)照組OD值] ×100%。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)加藥組和未加藥組細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.2.4DNA Ladder測定 常規(guī)消化收集細(xì)胞，PBS洗一遍，按試劑盒步驟裂解細(xì)胞，RNase作用，蛋白沉淀，提取DNA，液氮中凍5 min，70%酒精洗DNA，真空抽干，溶于TE緩沖液中，常規(guī)1.5%瓊脂糖電泳，電壓60 v，電泳2 h，觀察，照相。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測定 取指數(shù)生長期細(xì)胞，采用PI檢測法，藥物作用48 h后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，PBS洗兩遍，重懸細(xì)胞于PBS中調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，加RNase及PI，避光4℃染色30 min，上機(jī)檢測。激發(fā)波長488 nm，檢測3×104個(gè)細(xì)胞，用ModiFit軟件分析

2 結(jié)果

2.1MTT試驗(yàn)結(jié)果 各濃度組藥物對(duì)HO-8910卵巢癌細(xì)胞株均有明顯的抑制增殖作用，同陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有量效和時(shí)效關(guān)系，抑制率同作用時(shí)間呈直線相關(guān)(P<0.01)。培養(yǎng)基DDP濃度為4 μmol/L，As2O3濃度分別為1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。其中2 μmol/L組在12、24、36、48、60小時(shí)抑制率分別為10.3%、22.6%、34.7%、47.5%、51.9%，8 μmol/L組在12、24、36、48、60 h抑制率分別為16.3%、37.5%、53.2%、82.3%，其中以8μmol/L作用60小時(shí)為最高(82.3%)(圖1)。

圖1 不同濃度藥物作用下卵巢癌細(xì)胞抑制率變化

2.2形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下每日觀察對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度和時(shí)間增加，低濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合和高濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用不同，主要表現(xiàn)在：⑴對(duì)卵巢癌細(xì)胞貼壁能力和集落性影響不同，2 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用72 h后，細(xì)胞貼壁能力稍下降，極少細(xì)胞脫落，細(xì)胞生長呈集落性；8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用24 h即可見細(xì)胞貼壁能力明顯下降，許多細(xì)胞脫落成漂浮生長狀態(tài)，隨作用時(shí)間延長， 脫落細(xì)胞逐漸增多，至60 h約有70%～80%的細(xì)胞呈懸浮生長，48 h時(shí)可見細(xì)胞集落生長特性明顯降低，細(xì)胞開始呈單個(gè)生長狀態(tài)，60h90%以上細(xì)胞呈單個(gè)生長狀態(tài)。⑵細(xì)胞大小和形狀變化：2 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用72 h后，細(xì)胞稍變小，大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)呈梭形，部分細(xì)胞變圓，8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用24 h時(shí)可見大多數(shù)細(xì)胞變圓變小，隨時(shí)間延長改變明顯，72小時(shí)所有細(xì)胞RNase大小和形狀同未加藥的卵巢癌細(xì)胞完全不同(圖2)。

圖2A 正常卵巢癌細(xì)胞(10 ×10倍)

圖2B 2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細(xì)胞(10 ×10倍)

圖2C 8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用24 h卵巢癌細(xì)胞(10 ×10倍)

圖2D 8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細(xì)胞(10 ×10倍)

2.3DNA Ladder測定 2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h未見DNA Ladder出現(xiàn)，8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h時(shí)可見 DNA Ladder出現(xiàn)(圖3)。

圖3 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3A:DNA Marker 圖3B:2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細(xì)胞 圖3C:8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用24 h卵巢癌細(xì)胞 圖3D:8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細(xì)胞

2.4流式細(xì)胞測定結(jié)果 經(jīng)濃度為2、8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合分別作用48 h，可見亞G1峰出現(xiàn)，而對(duì)照組未見亞G1峰；藥物組S+ G2～M期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯增高，且隨濃度增高而增高；低濃度和高濃度及對(duì)照組在凋亡率、細(xì)胞周期上的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4A 圖4A 正常卵巢癌細(xì)胞

3 討論

As2O3、DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用[3]。但單用時(shí)都需較高濃度才能達(dá)到理想效果。而DDP在治療劑量內(nèi)仍對(duì)人體有嚴(yán)重的腎毒性和骨髓抑制等不良反應(yīng)。因此選擇最低有效劑量的DDP應(yīng)用于臨床,對(duì)降低其毒副作用具有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)As2O3、DDP聯(lián)合作用時(shí)癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于單藥組,表明兩者有協(xié)同作用。特別是當(dāng)As2O3濃度為8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L時(shí),癌細(xì)胞幾乎全部死亡,大大高于相應(yīng)單藥組[4]。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅同腫瘤細(xì)胞的增殖和分化異常有關(guān)，而且同細(xì)胞凋亡基因的變化有關(guān)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為近年來腫瘤治療方面的重點(diǎn)。細(xì)胞凋亡時(shí)的特點(diǎn)主要為形態(tài)和生化方面的改變，細(xì)胞體積變小，染色體凝聚成新月狀，出現(xiàn)凋亡小體等特點(diǎn)；同時(shí)染色體由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用產(chǎn)生180～200 bp的梯狀片斷。本組研究中不同濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合均可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，且有時(shí)效和量效關(guān)系，抑制率以8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L為最高。倒置顯微鏡下有細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)改變，但在低濃度時(shí)未觀察到出現(xiàn)，DNA凝膠電泳表現(xiàn)出典型的“梯形”條帶，流式細(xì)胞儀檢測有細(xì)胞凋亡峰出現(xiàn)[5]。

通過以上觀察結(jié)果，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株凋亡的作用是肯定的，但與濃度有關(guān)。低濃度抑制細(xì)胞增殖并不是通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，其機(jī)制有待于探討。進(jìn)一步分析三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對(duì)卵巢癌細(xì)胞株周期的影響發(fā)現(xiàn)，其可阻滯細(xì)胞于S+ G2～M期，且在8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L后隨濃度增加抑制率并不增加，表明三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)機(jī)制可能為周期特異性藥物，提示在應(yīng)用時(shí)合用對(duì)S及 G2～M期敏感的藥物可能有助于提高療效[6]。

綜上所述，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株HO8910的凋亡，但存在濃度差異，在低濃度時(shí)抑制細(xì)胞增殖但沒有啟動(dòng)凋亡，但在高濃度時(shí)抑制細(xì)胞凋亡為主；并使細(xì)胞周期阻滯于S+ G2～M期，這為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[7]。

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StudiesonArsenictrioxideandCisplatininducesapoptosisinOvarianCancercelllinesHO8910

GAOHong-quan，ZHANGAi-qing，TIANZhong-fu.
XiamenMedicalCollage157011，China

ObjectiveThe current study was designed to investigate whether Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.MethodsCell proliferation was assessed by MTT assays.Morphological changes of apoptosis were observed with invert microscope . DNA ladder and cell cycle were examined by DNA agarose gel eletronphores and PI fluorescence flow cytometry(FCM).ResultsUnder the influence of Arsenic trioxide and Cisplatin, HO8910 cell exhibited changes of apoptosis both in morphology and in the characteristics of electrophoresis.Meanwhile the cell cycle also showed special change.ConclusionArsenic trioxide and Cisplatin can inhibit cell proliferation, Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.

Arsenic trioxide； Cisplatin； apoptosis； Ovarian Cancer cell line

福建省教育廳基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2011)；廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；痦?xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2009)

361008 廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校