周雪雁，劉翊中，陳軼霞，李 倬，劉俊林

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

腸球菌(Enterococcus)屬于鏈球菌科腸球菌屬，是人類和動物腸道正常菌群的一部分，其數(shù)量僅次于大腸埃希菌。1989年，依據(jù) Facklam和Collins［1］的分類，腸球菌屬內(nèi)包括12個種及1個變異株，按照其利用糖類的特征可將腸球菌分為3組:第1組以鳥腸球菌(E.avium)為代表;第2組以糞腸球菌(E.faecalis)為代表;包括屎腸球菌(E.faecium)等;第3組以堅韌腸球菌(E.durans)為代表。糞腸球菌又叫糞鏈球菌，是腸球菌屬的模式種，為條件致病菌，當抗生素大量使用或宿主免疫力低下時，會引起感染性疾病的發(fā)生發(fā)展［2］。但糞腸球菌很多正常的生理特性是有益的，對維持腸道正常菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用［3］。早期對于糞腸球菌的分類和鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生理生化反應(yīng)試驗和免疫學(xué)反應(yīng)進行［4］。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，特別是聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR)的發(fā)明，其中16S rRNA基因的序列同源性分析，建立細菌系統(tǒng)發(fā)育樹已經(jīng)成為細菌種屬鑒定的標準方法，在細菌的分類研究中起著重要的作用。目前大約2500個種的16S rRNA全序列已經(jīng)被報道。根據(jù)它們的序列同源性，已經(jīng)構(gòu)建了各種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹［5］。本試驗通過分離純化培養(yǎng)、生理生化反應(yīng)試驗及16S rRNA序列分析法對分離菌株進行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集及處理 本試驗的樣品來源于甘肅天祝散養(yǎng)健康白牦牛的新鮮糞樣。樣品無菌采集后盡快接入糞腸球菌選擇性培養(yǎng)基中，置于厭氧條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑 糞腸球菌選擇性培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，g):蛋白胨10，麥芽糖20，酵母浸粉10，甘油磷酸鈉10，氯化鈉5，乳糖1，溴甲酚紫0.015，疊氮鈉 0.4，TTC 0.1，瓊脂 13，加熱溶解于1 L 蒸餾水中，pH 值 7.2 ±0.2，煮沸 5 min，冷至50℃左右，傾入無菌平皿，備用。明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基、單糖發(fā)酵培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚試驗)、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(甲基紅試驗)，檸檬酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛瓊脂培養(yǎng)基7種鑒別培養(yǎng)基，革蘭染色液、3% ～15%H2O2、1.6 g/100 mL 溴甲酚紫、格里斯氏試劑(A、B液)、二苯胺試劑、碘液、甲基紅試劑等。

1.2 方法

1.2.1 待測菌株的分離純化 ①樣品稀釋:在無菌條件下，用無菌移液管吸取1 mL混合均勻的液體樣品，加入裝有三蒸水的試管中，將其混合均勻，制成 10－1稀釋液;②涂布:將 10－1稀釋液1 mL接入糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基中，用涂布棒將菌液涂布均勻;③培養(yǎng):將接種好的平板培養(yǎng)基倒置于厭氧罐中，37℃厭氧培養(yǎng)，2～4 d后觀察生長的菌落，用于進一步分離純化。通過以上樣品稀釋液的分離培養(yǎng)，從生長的菌落中挑取單菌落于糞腸球菌瓊培養(yǎng)基上進行2～3次純化［6］。

1.2.2 分離菌株的鑒定 ①菌落形態(tài)與染色特征觀察:挑取分離純化的單菌落再次劃線接種于固體培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)48～72 h后，進行菌落形態(tài)觀察，并記錄該菌的菌落形態(tài)特征。挑取培養(yǎng)48～72 h的菌落涂片，革蘭染色并鏡檢，觀察菌體形態(tài)和顏色。將初步鑒定為腸球菌的菌落接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，進行厭氧增菌培養(yǎng)，以便下一步生化試驗鑒定［7］;②生化試驗鑒定:將接種于液體培養(yǎng)基中的分離菌進行生化反應(yīng)特性測試。生化反應(yīng)包括接觸酶試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽試驗、葡萄糖反應(yīng)、乳糖反應(yīng)、果糖反應(yīng)、半乳糖反應(yīng)、蔗糖反應(yīng)、木糖反應(yīng)、纖維二糖反應(yīng)、核糖反應(yīng)等生化特性鑒定。試驗結(jié)果對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第9版)進行綜合判定［8］;③分子生物學(xué)鑒定:a.16S rRNA PCR擴增:裂解菌體細胞，PCR反應(yīng)模板的獲取:取50 μL Lysis Buffer FOR Microorganism to Direction PCR TaKaRa code No.D304于滅菌的Microtube中。用滅菌牙簽或槍頭挑取單菌落(將分離菌株劃線于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h)，置于Microtube中攪動幾下后取出，80℃熱變性15 min后低速離心，取1～5 μL裂解后的上清液作為PCR反應(yīng)的模板。

表1 16S rRNA PCR反應(yīng)體系Table 1 16S rRNA PCR reaction system

引物序列:1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(Y，M為簡并堿基分別代表 C/T，A/C)。PCR的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性7 min，循環(huán)從94℃變性1 min開始，50℃退火1 min，最后在72℃延伸1.5 min結(jié)束，30個循環(huán);最后72℃、10 min充分延伸。取9 μL擴增產(chǎn)物進行電泳，并用分子量為DL2000 Marker作參照，電壓為100 V，瓊脂糖凝膠為1%，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照［9］;b.16S rRNA 基因擴增產(chǎn)物的序列測定:按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明對擴增產(chǎn)物進行回收。將切膠回收純化的擴增產(chǎn)物直接送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序。測定的DNA序列以雙鏈堿基互補的結(jié)果為準;c.16S rRNA基因序列分析:將所測分離株的16S rRNA基因序列與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已登錄的相關(guān)序列(表2)進行同源性分析，利用DNAstar軟件中MEGA5.0繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹［10］。

表2 16S rRNA序列比對中應(yīng)用的相關(guān)序列Table 2 The 16S rRNA gene sequences used in sequence alignment

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的菌落特征

將培養(yǎng)了2～4 d的菌落進行觀察，在糞腸球菌選擇性培養(yǎng)基上的菌生長旺盛，菌落特征一致為圓形，邊緣整齊，表面光滑，扁平隆起，呈現(xiàn)有乳白色、不透明，白瓷瓦狀，菌落大小1～2 mm，黏稠濕潤。如圖1所示，該菌株命名為M.D.E1。

圖1 分離菌的培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Culture lones of the isolates

2.2 分離菌株的革蘭染色結(jié)果

通過革蘭染色并鏡檢，觀察到所分離的菌為陽性菌，形態(tài)為球形、橢圓形，呈單個、成對或短鏈狀排列，無鞭毛、無芽胞。如圖2所示。

圖2 分離菌的革蘭染色結(jié)果Fig.2 Gram staining result of the isolates

2.3 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

將待測菌株M.D.E1通過生化試驗測定，其具體試驗結(jié)果見表3和表4。分離株的生化鑒定結(jié)果與標準腸球菌株結(jié)果相符。

表3 16S rRNA序列比對中應(yīng)用的相關(guān)序列Table 3 The biochemical reaction results of M.D.E1

表4 M.D.E1的生化試驗(糖發(fā)酵試驗)結(jié)果Table 4 The sugars fermention test results of M.D.E1

2.4 分離菌株16S rRNA基因擴增結(jié)果

凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳可見16S rRNA基因在約1500 bp處有1條特異性亮帶，與預(yù)期片段大小相符(如圖3所示)。

圖3 16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖結(jié)果Fig.3 The agarose gel electrophoresis results of the 16S rRNA PCR amplification products

2.5 分離菌株16S rRNA序列比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建

分離菌株的16S rRNA測序結(jié)果為1544 bp;由于是PCR產(chǎn)物直接測序，經(jīng)Blast比對，盡可能把拼接后的不可靠序列刪去，因此長度基本與預(yù)期相符。序列比對得到的打分矩陣如圖4，打分矩陣清晰地顯示了菌株M.D.E1與GenBank提交的糞腸球菌相似性都大于97.5%，通常認為2條16S rRNA序列的相似性大于97.5%則認為這2條序列來源的物種為同一物種［5］。所以可以推定菌株M.D.E1為糞腸球菌。菌株M.D.E1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖5，由進化樹可以看出菌株M.D.E1與糞腸球菌的分化距離較短(Nucleotide Substitutions=60)。

圖4 分離菌M.D.E.與相關(guān)菌的16S rRNA基因間同源性打分矩陣Fig.4 The sequence homology distances of 16S rRNA genes between the isolated M.D.E1.and related bacteria

圖5 分離株M.D.E.與代表性糞腸球菌的16S rRNA基因進化樹Fig.5 Bootstrapped neighbour joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene of isolated M.D.E1.

3 討論

糞腸球菌屬于需氧或兼性厭氧菌，本試驗利用厭氧罐進行厭氧培養(yǎng)以達到分離的目的。采用實驗室傳統(tǒng)純培養(yǎng)和生化試驗方法，鑒定糞腸球菌會存在一定程度的誤差，本試驗通過16S rRNA測序構(gòu)建了16S rRNA進化樹，分離株與其他參照糞腸球菌在一個大分支中，且在同源性分析中，同源率大于97.5%。傳統(tǒng)的生理生化方法及16S rRNA系統(tǒng)進化分析，只能初步確認該分離株為糞腸球菌。進一步鑒定需要通過DNA雜交和脈沖場電泳技術(shù)［11］，最終應(yīng)將待測菌株的全基因組序列與標準株全序列進行比對才能做出準確鑒定［12］。盡管糞腸球菌是人和動物正常菌群之一，但它為條件致病菌，可以引起尿路感染、化膿性腹部感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腹瀉發(fā)燒等多種疾病。據(jù)報道腸球菌是內(nèi)源性和外源性醫(yī)院感染的第二大病原菌，檢出率僅次于大腸埃希菌［13］。而且研究表明腸球菌還極易形成耐藥性，表現(xiàn)為氨基糖甙類耐藥，耐β-內(nèi)酰胺類及糖肽類，耐萬古霉素等，在臨床分離的腸球菌中有許多是多重耐藥菌株［14］。另外，很多分離菌株，能產(chǎn)生一種叫腸球菌素(Enterocin)的細菌素，對單增李斯特菌和其他乳酸菌有殺滅作用［15］。美國研究人員 Moore DR 等［16］研究表明糞腸球菌能產(chǎn)生有害化學(xué)物質(zhì)，破壞DNA，進而引起促發(fā)直腸癌的基因活動。因此，將糞腸球菌作為益生菌存在爭議，國際益生菌產(chǎn)品協(xié)會(International Probiotics Association)和世界衛(wèi)生組織(WHO)均建議:益生菌中不宜使用腸球菌［17］。但國內(nèi)仍有公司在生產(chǎn)糞腸球菌作為飼料添加劑，有關(guān)糞腸球菌的生理特性、作用及用途還有待于國內(nèi)外學(xué)者進一步探討和研究。

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