楊 玲，孟慶磊，張龍崗，張志山，安 麗，董學颯，劉羽清,付佩勝 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250117)

草魚MHCclassⅠ基因多態(tài)性及其與魚體抗柱形病能力關系分析

楊 玲，孟慶磊，張龍崗，張志山，安 麗，董學颯，劉羽清,付佩勝 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250117)

用1對引物HMC6-S和MHC6-A分別從草魚(Ctenopharyngodonidellus)40尾抗病個體和40尾易染個體的基因組DNA中擴增MHC基因片段，擴增產(chǎn)物長度為262bp。在262bp的核苷酸序列中，有50個(19%)多態(tài)位點。在其編碼的87個氨基酸位點中，有16個多態(tài)位點(18.39%)，其中有10個位點發(fā)生在多肽結(jié)合位點上(62.5%)。對核苷酸替代的類型和位點進行分析，發(fā)現(xiàn)多肽結(jié)合位點的非同義堿基替代率與同義堿基替代率均大于非多肽結(jié)合位點的非同義堿基替代率與同義堿基替代率，表明氨基酸替代替換集中出現(xiàn)在多肽結(jié)合位點(PBR)上。分析80個個體的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有17種不同的MHC class Ⅰ等位基因，編碼17種不同的氨基酸序列。等位基因A、B、C、D是2個群體共有的，其中等位基因A出現(xiàn)的頻率最高，占總樣本數(shù)量的36.25%；等位基因E、F、G、H、I、P只出現(xiàn)在抗病個體中，等位基因J、K、L、M、N、O、Q只出現(xiàn)在易染個體中。

主要組織相容性復合體(MHC)；MHC class Ⅰ多態(tài)性；抗病力；草魚(Ctenopharyngodonidellus)

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)，是存在于脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原的一組緊密連鎖的基因群，各類生物MHC基因的生物學功能都是相同的，主要是識別、清除外來和內(nèi)在抗原，在免疫反應中起著重要作用，與機體免疫應答、免疫調(diào)節(jié)和移植排斥等有關。

MHC 基因可分為MHCⅠ類和MHCⅡ類分子，2類分子均參與抗原的提呈過程，存在多態(tài)性的抗原結(jié)合位點。Ⅰ類基因由2 條分開的肽鏈組成，一條為MHC 編碼的α 鏈(或稱為重鏈) ，由3 個片段(α1、α2 和α3) 組成; 另一條為β 鏈(或稱為輕鏈) ，但不是由MHC 編碼，β 鏈屬于β-2 微球蛋白(簡稱為β2m) 。Ⅱ類分子由2 條非共價的結(jié)構(gòu)相似的多肽鏈(α 鏈和β 鏈) 組成，每條鏈均有2 個功能區(qū)，即α1、α2 和β1、β2，每個功能區(qū)含90 個氨基酸和1 個約25 個氨基酸的跨膜區(qū)。在哺乳動物中還存在Ⅲ類基因，通常位于Ⅰ類基因與Ⅱ類基因之間，編碼控制某些補體成分和其受體產(chǎn)生的基因。

草魚(Ctenopharynodonidellus)隸屬于鯉形目鯉科草魚屬，是我國“四大家魚”之一，然而草魚的病害較多，是我國淡水魚類養(yǎng)殖中死亡率最高的魚種，年存活率僅為15% ～30%。常見病有草魚爛鰓病(即柱形病，其病原菌為柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)、腸炎病、赤皮病，出血病等10多種。為了闡明草魚MHC 等位基因的多態(tài)性及其與疾病間的關系，首先篩選出抗病個體和易染個體各40個，并根據(jù)Genbank(EF584535.1)中MHC classⅠα1區(qū)的序列設計1對引物MHC6-S和MHC6-A，對其基因組DNA進行擴增，結(jié)果顯示MHC I 等位基因呈現(xiàn)高度多態(tài)性，變異幅度大，這種變異具有種屬分子特征，并可能與草魚對疾病的特異抵抗力或易感性有關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究通過自然選擇和人工選擇的方法，選用3個草魚群體(分別為長江野生群體、野生親本人工繁育一代群體、養(yǎng)殖群體)各200條，利用柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)進行攻毒試驗。試驗期間還得了小瓜蟲病。通過攻毒試驗和自然選擇，共篩選出抗病個體40尾和易染個體40尾，易染個體為最先得病死亡的個體，抗病個體為不發(fā)病也一直不死亡的個體。對于易染個體，根據(jù)死亡先后順序編號，并迅速轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱中備用；抗病個體打上標記(T型標記)并記錄好編號，剪取少許尾鰭，放-20℃冰箱中備用。

試驗所用的PCR引物由上海生工生物工程公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP 、MgCl2、Marker等為大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；PCR儀為德國PEQSTAR 10AT型。

1.2 引物設計

根據(jù)Genbank中草魚MHC classⅠα1區(qū)的序列設計一對基因特異性引物MHC6-S(5′ TTACCCTTTGACTGGTTAAA 3′)和MHC6-A(5′ TTTCTTTGTCCACAGGAACACACTC 3′)，對其基因組DNA進行擴增，用于草魚MHC classⅠ基因的多態(tài)性分析。

1.3 DNA提取和PCR擴增

對于易染個體，取其背部肌肉提取基因組DNA，對于抗病個體，則剪取少許尾鰭，采用上海生工生物工程公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(SK8252)提取基因組DNA。PCR擴增反應總體積為50μl，其中10×Buffer(Takara)5μl，MgCl2(25mmol/L)4μl，dNTP(Takara，各2.5mmol/L)4μl，Taq聚合酶(Takara，5U.μl-1)0.5μl，上、下游引物(10μmol/L)各1μl，模板DNA3μl，補足滅菌雙蒸水至50μl。

反應條件為：94℃預變性5min，之后進行35個循環(huán)(94℃ 40s，55℃ 50s，72℃ 50s)，最后72℃延伸10min。

1.4 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TBE 5V/cm恒壓)進行檢測，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司純化，并進行雙向測序，測序反應采用和PCR反應一致的正、反向引物。

1.5 序列多態(tài)性分析

用MEGA 5.1軟件的Clustal W軟件進行多重比對分析，并輔以人工校對，確定變異位點和不同序列。利用MEGA 5.1軟件計算多態(tài)位點、統(tǒng)計序列的堿基組成和轉(zhuǎn)換/顛換比率(Ts/Tv ratios)、計算相對遺傳距離(P-distance),用臨位相聯(lián)法(neighbor-joining，NJ)方法構(gòu)建進化樹。用改良的Nei-Gojobori (p-distance)方法統(tǒng)計非同義堿基替換(dN)和同義堿基替換(dS)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHC classⅠ基因的多態(tài)性

本試驗共對80個個體的PCR產(chǎn)物進行了雙向測序，結(jié)果表明，在262bp的核苷酸序列中，有50個核苷酸變異位點，其中28個顛換(si)，16個轉(zhuǎn)換(sv)，6個既有轉(zhuǎn)換又有顛換(si+sv)，轉(zhuǎn)換/顛換比值R=si/sv為0.57。這262bp的核苷酸共編碼87個氨基酸，是草魚MHC classⅠα1區(qū)的氨基酸序列，80個個體共有17種不同的氨基酸序列，與人類MHC(HLA-A2)基因的比較結(jié)果見圖1。

b ：示人(HLA-A2)與抗原多肽結(jié)合的氨基酸； . ：示抗原多肽結(jié)合的關鍵性氨基酸；p ： 表示人(HLA-A2)與抗原多肽結(jié)合的相關性氨基酸；＊ ：示缺失；-：示與等位基因A一致的氨基酸序列

與人類MHC(HLA-A2)基因的氨基酸序列進行比對分析，確定本研究所得草魚HMC classⅠ基因的氨基酸區(qū)段對應位點為1～87。在這17種不同的氨基酸序列中，都保留了人HLA-A2與抗原多肽結(jié)合的3個關鍵性氨基酸，即第7位、第59位和第84位的酪氨酸(Y)；與抗原多肽結(jié)合的相關性氨基酸(p)則部分保守,15個與抗原多肽結(jié)合相關性氨基酸中有4個氨基酸位點存在多態(tài)性(26.67%)，分別在第61位、65位、69位和79位，具有2種或3種不同的的氨基酸變異；與抗原多肽結(jié)合氨基酸(b)位點共有39個，其中10個位點存在多態(tài)性，占25.64%；在總的87個氨基酸序列中，共有16個變異位點( 18.39%)，在這16個變異位點中，其中有10個是在多肽結(jié)合位點(PBR)上。縱觀該α1區(qū)的氨基酸變異位點，比較集中出現(xiàn)在形成α螺旋的區(qū)域(第61～80位氨基酸)，該區(qū)共有11個多態(tài)位點，占該螺旋區(qū)的55%，占總多態(tài)位點的68.75%。

對核苷酸替換的類型及位點進行分析，發(fā)現(xiàn)多肽結(jié)合區(qū)域非同義堿基替換與同義堿基替換的數(shù)值均大于非多肽結(jié)合位點的非義堿基替換與同義堿基替換值，表明氨基酸替換較多出現(xiàn)在抗原結(jié)合區(qū)(PBR)附近(表1)。

表1 草魚17個不同的MHC class Ⅰ α1 區(qū)序列每個核苷酸位點的同義堿基替換(dS)和 非同義堿基替換(dN)分析結(jié)果

利用MEGA 5.1中的P-distance軟件計算出這17種不同的MHC基因核苷酸序列的遺傳距離，平均遺傳距離為0.043(表2)。采用臨位相聯(lián)法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。分析表明，這17個等位基因和Genbank(ABU86893)中的草魚聚成一個分支，與鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)的同源關系最近，與斑馬魚(Daniorerio)的同源關系次之，與金魚(Carassiusauratus)、約氏魮(Barbusintermedius)同源關系較遠，與小鼠(Mouse)和人類(Human)的同源關系最遠。

表2 17種不同的草魚MHC class Ⅰ核苷酸序列的遺傳距離

圖2 草魚的17個不同的MHC class Ⅰ 基因型與其他生物對應序列的系統(tǒng)進化樹

2.2 MHC class Ⅰ等位基因的多態(tài)性及與抗病力的關系

草魚17種不同的等位基因在抗病群體和易染群體中的分布情況見表3，在17種不同的氨基酸序列中，等位基因A、B、C、D是抗病群體和易染群體所共有的，不同等位基因在易染群體分布與抗病群體分布頻率見圖3,在2個群體共有的5種氨基酸序列中，等位基因A出現(xiàn)的頻率最高，在抗病群體中占42.5%，在染病群體中占30%，占總樣本數(shù)量的36.25%，等位基因B、C、D在抗病群體和染病群體占有相同比例，等位基因E、F、G、H、I、P只出現(xiàn)在抗病個體中，它們出現(xiàn)的頻率分別為10%、7.5%、7.5%、7.5%、5%、5%，等位基因J、K、L、M、N、O、Q只出現(xiàn)在染病個體中，其頻率分別為15%、12.5%、10%、5%、5%、5%、2.5%。

表3 不同等位基因在染病群體與抗病群體的分布情況

圖3 不同MHC class Ⅰ 等位基因在抗病群體和染病群體中的分布頻率

3 討論

主要組織相容性復合體(MHC)是脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的編碼細胞表面免疫球蛋白樣受體的異二聚體，具有高度多態(tài)的基因群,其表達產(chǎn)物分布于各種細胞的表面，某些基因型與生物體抗病力存在一定的相關關系。MHC基因具有高度多態(tài)性,在魚類中的多態(tài)現(xiàn)象也很明顯，其中抗原結(jié)合位點(peptide binding region,PBR) 是最重要的可變區(qū)域，MHC 的等位基因通常在PBR 區(qū)域存在高比例的非同義替代[1]。通常認為,MHC 的變異和新等位基因的產(chǎn)生是點突變、重組和現(xiàn)存等位基因之間轉(zhuǎn)換的結(jié)果。研究表明,MHC 的高度多態(tài)性是自然選擇和性別選擇的結(jié)果[2-4]。在MHC多態(tài)性研究方面，Ⅰ 類基因中,夏春等[5]和Aoyagi等[6]先后在虹鱒中發(fā)現(xiàn)了a 的多個等位基因; Dijkstra等[7]發(fā)現(xiàn)bOnmy2UCA 和Onmy2UDA 分別有7 個和8 個等位基因。夏春等[8]在草魚發(fā)現(xiàn)了a 的11 個等位基因、Cuesta等[9]在金頭鯛中分別發(fā)現(xiàn)了a 的 2 個等位基因。Stet等[10]發(fā)現(xiàn)在大西洋鮭的Ⅱ 類A 的3非翻譯區(qū),每一個單倍型都有1 個獨特的微衛(wèi)星標記; 蔡完其等[11]發(fā)現(xiàn)紅鯉Ⅰ 類分子的α2 鏈適宜作為不同群體的分子遺傳標記;

MHC最重要的功能之一表現(xiàn)在免疫方面，Dijkstra等[12]發(fā)現(xiàn)虹鱒的類Onmy2UBA在傳染性造血器官壞死病毒(IHNV) 感染后的性腺細胞系中的表達量上升；Landis 等[13]發(fā)現(xiàn)虹鱒的Ⅰ類b 在病毒感染后表達量上升。在MHC等位基因與抗病關系的研究方面，Kjglum等[14]發(fā)現(xiàn)大西洋鮭的Ⅰ類的UBA*0201 和UBA*0301 是最有抗性的等位基因; UBA*0601 和Ⅱ 類A 的DAA*0301 是最敏感的等位基因; 而Ⅰ和Ⅱ 類的基因型組合UBA*0201/*0301、DAA*0201/*0201 是最具抗性的; 基因型組合UBA*0601/*0801、DAA*0501/*0501 和UBA*0201/*0301、DAA*0301/*0501 是最易感的。張玉喜等[15]通過研究牙鲆MHC class Ⅱ B基因研究，發(fā)現(xiàn)有13種不同的氨基酸序列，其中等位基因g和h只出現(xiàn)在抗病個體中，等位基因l只出現(xiàn)在感病個體中，為篩選牙鲆抗病相關基因標記和利用抗病基因型進行抗病選育奠定了基礎。Johnson等[16]發(fā)現(xiàn)了虹鱒Ⅰ類b在抗細菌冷水病的作用,以及8個和b基因緊密連鎖的標記。

在草魚MHC研究方面，張燕等[17]在長江草魚群體MHC Class Ⅱ B的多態(tài)性和進化分析中，草魚長江3個群體的主要組織相容性復合體(MHC)Class Ⅱ B基因，分析了草魚MHC的進化模式和種群遺傳結(jié)構(gòu)，推測草魚至少存在5個MHC Class Ⅱ座位。基于等位基因頻率的AMOVA分析，顯示長江草魚群體MHC等位基因分布沒有顯著差異。楊天耀[18]在克隆Ctid-β_2m分子基礎上,分析了Ctid-MHC Ⅰ多樣性;并對Ctid-MHC Ⅰ在各組織的表達進行了定量，表達、鑒定了Ctid-MHC Ⅰ重組蛋白，解析了Ctid-MHC Ⅰ和Ctid-β_2m的分子特征。

在本研究中，草魚MHC class Ⅰ的α1區(qū)的262個核苷酸序列中，有50個核苷酸變異位點，多態(tài)位點占總序列的19%，在其編碼的87個氨基酸中，共有16個變異位點，其中有10個發(fā)生在多肽結(jié)合位點(PBR)上，并且變異位點比較集中出現(xiàn)在形成α螺旋的區(qū)域(第61～80位氨基酸)，該螺旋區(qū)共有11個變異位點，占該區(qū)氨基酸位點的55%。充分證明了草魚MHC class Ⅰ基因具有高度的多態(tài)性，α1區(qū)的變異位點集中出現(xiàn)在形成α螺旋區(qū)域。

在草魚MHC class Ⅰ的17種不同氨基酸序列中，等位基因E、F、G、H、I、P只出現(xiàn)在抗病個體中，等位基因J、K、L、M、N、O、Q只出現(xiàn)在染病個體中，為篩選草魚抗病相關基因標記提供了參考，進一步可以作為分子遺傳標記進行抗病相關標記輔助育種。

草魚是我國淡水漁業(yè)重要養(yǎng)殖品種，也是病害嚴重的魚類，病害是制約我國草魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，草魚常見病有爛鰓病(即柱形病)、赤皮病、腸炎病、出血病等10多種，前3種俗稱草魚“三大病”，其中爛鰓病是引起草魚死亡的主要病害，其病原菌為柱狀黃桿菌。隨著對草魚MHC 方面研究的積累，應用MHC 篩選抗病分子標記進行抗病性狀的選擇育種，用含抗性MHC 等位基因的親魚進行抗病育種改良,培育高抗病力新品種，將會有突破性的進展，MHC 系統(tǒng)將在未來草魚的研究領域中有更為廣闊的前景。

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2013-03-20

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目。

楊 玲(1967-)女，研究員,主要從事魚類遺傳育種研究。

[作者簡介]付佩勝，E-mail:jnsfu@126.com。

Q78；Q959.46+8

A

1673-1409(2013)17-0042-06