溫凌子，楊玉瑩，梁雄燕，顧玉芳，多 婷，易艷芳 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

湖北省雞群內(nèi)源性禽白血病病毒分子特征研究

溫凌子，楊玉瑩，梁雄燕，顧玉芳，多 婷，易艷芳 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為了解內(nèi)源性禽白血病病毒在我國(guó)雞群中的存在狀況，利用特異性引物對(duì)湖北省雞群—江漢雞和靈山麻雞的雞胚中內(nèi)源性禽白血病病毒進(jìn)行了PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有的雞胚中均檢測(cè)出內(nèi)源性禽白血病病毒EAV、ev、ev/J和ART-CH基因序列。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于內(nèi)源性病毒原型株E51，江漢雞的EAV基因組更加接近于原型株EAV-0；江漢雞和靈山麻雞的ART-CH核苷酸序列之間相似度很高，但與已知的ART-CH5和ART-CH14核苷酸序列存在較大差異；盡管江漢雞和靈山麻雞的ev和ev/J核苷酸與其他已知的ev和ev/J的相關(guān)序列差異較小，但其在系統(tǒng)進(jìn)化樹上仍屬于不同的分支。該結(jié)果說明江漢雞和靈山麻雞的內(nèi)源性病毒基因的進(jìn)化路徑與其他已知的內(nèi)源性病毒基因的進(jìn)化路徑不同。

內(nèi)源性禽白血病病毒，ev基因座，ev/J，ART-CH

內(nèi)源性禽白血病病毒(EndogenousAvianLeucosis/SarcomaVirus,EALSV)是一種存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復(fù)制的前病毒DNA序列，主要包括CR1(chickenrepeat1,CR1)、ev基因座、內(nèi)源性禽反轉(zhuǎn)錄病毒(endogenousavianretrovirus，EAV)和雞基因組禽反轉(zhuǎn)座子ART-CH[1-2]。由于EALSV涉及到外源性反轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)化、反轉(zhuǎn)錄病毒的致病機(jī)制等，特別是ev/J是具有外源性病毒對(duì)應(yīng)體的少有的幾個(gè)內(nèi)源性病毒之一，在反轉(zhuǎn)錄病毒中很有代表性，近些年來受到廣泛的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，ev基因座與E亞群禽白血病病毒相關(guān)，每種雞的基因組中平均約有5個(gè)ev基因座[1,3]。EAV序列高度保守，僅存在于所有的原雞屬物種中，EAV家族成員不表達(dá)傳染性病毒粒子，但其具有RT活性，并且已經(jīng)在活疫苗中被證實(shí)[3-4]；ART-CH屬于反轉(zhuǎn)座子，是一種相對(duì)較小的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒序列，其gag區(qū)與禽白血病病毒的相應(yīng)區(qū)域同源性約為35%[5]。ev/J與其他所有的內(nèi)源性禽白血病病毒序列明顯不同，其env區(qū)域與J亞群禽白血病病毒(AVL-J)的env基因同源性超過95%，因此被認(rèn)為是AVL-Jenv基因的起源[6-8]。

內(nèi)源性禽白血病病毒在我國(guó)雞群中的存在狀況尚不清楚，本研究采用特異性引物對(duì)湖北省重要雞群江漢雞和靈山麻雞進(jìn)行內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒PCR檢測(cè)，旨在分析湖北省重要雞群內(nèi)源性禽白血病病毒的相關(guān)生物學(xué)特性，為進(jìn)一步探索內(nèi)源性禽白血病病毒與外源性病毒的進(jìn)化、致病機(jī)理、免疫耐受等提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

江漢雞受精卵10枚，購(gòu)自武漢三益家禽育種有限公司；靈山麻雞受精卵10枚，購(gòu)自湖北省荊州市天羽禽業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑

Taq酶，dNTP等PCR試劑、pMD19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物、PCR產(chǎn)物回收試劑盒為上海捷瑞生物公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為北京鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品。

1.3 方法

(1)DNA模板制備 將2個(gè)品系雞待用受精卵孵育至11日齡。取雞胚組織，用改良的酚氯仿法[9]提取DNA，溶于滅菌雙蒸水中，-20℃保存。

(2)內(nèi)源性禽白血病病毒基因擴(kuò)增 內(nèi)源性禽白血病病毒的特異性引物見表1。EAV基因的特異性引物(F1/R1)分別位于env基因的跨膜蛋白(TM)編碼區(qū)和長(zhǎng)末端重復(fù)序列區(qū)(LTR)；ART-CH特異性引物(F2/R2)根據(jù)其gag基因設(shè)計(jì)；ev基因座和ev/J特異性引物(F3/R3-F8/R8)根據(jù)其各自env基因設(shè)計(jì)。

表1 內(nèi)源性禽白血病病毒特異性引物

PCR采用25μl反應(yīng)體系，包括1μl模板DAN、2.5μl的10×buffer、2.5μl的MgCl2(25mmol/L)、1.5μl的2.5mmol/L dNTPs、1μl的正向引物(25pmol)、1μl的反向引物(25pmol)、0.5μl的Taq聚合酶(5U/μl)、16μl ddH2O。循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性2min，主循環(huán)94℃1min，退火1min(各引物退火溫度詳見表1)，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色分析[7]。

(3)目標(biāo)片段的克隆轉(zhuǎn)化 按照試劑盒說明，分別對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到的純化回收產(chǎn)物，溶解于ddH2O，-20℃保存。連接反應(yīng)體系組成為純化目的DNA片段2.5μl、pMD19-T Simple Vector 0.2μl、SolutionⅠ2.5μl，16℃連接過夜。采用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌[7]。使用試劑盒，進(jìn)行小量質(zhì)粒的提取，特異性PCR鑒定陽性克隆。

(4)DNA片段的測(cè)序及序列分析 陽性克隆菌送北京諾賽基因公司測(cè)序，結(jié)果用核酸分析軟件Lasergene分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

內(nèi)源性禽白血病病毒特異性PCR顯示，江漢雞與靈山麻雞均擴(kuò)增出EAV、ev、ev/J和ART-CH4種內(nèi)源性病毒序列，但是二者又存在差異，ev基因座特異性引物F3/R3未能從靈山麻雞基因組擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段。

根據(jù)使用內(nèi)源性禽白血病病毒特異性引物的不同，從2個(gè)品系雞中擴(kuò)增得到的DNA片段，分別命名為江漢雞：JF1～JF8;靈山麻雞：LF1～LF8。

2.2 目標(biāo)片段的克隆與測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector連接轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)的內(nèi)源性禽白血病病毒特異性引物分別對(duì)轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行PCR鑒定，均擴(kuò)增出了預(yù)計(jì)大小條帶(圖1，圖2)，表明目的片段克隆成功。測(cè)序結(jié)果顯示，JF1～JF6、JF8大小分別為241bp、659bp、1958bp、881bp、713bp、266bp、785bp；LF1、LF2、LF4～LF6、LF8大小分別為241bp、659bp、881bp、713bp、266bp、785bp。

M:DNAMarker;1:JF1;2:JF2;3:JF3;4:JF4;5:JF5;6:JF6;7:JF7;8:JF8

M:DNAMarker;1:JF1;2:JF2;3:JF4;4:JF5;5:JF6;6:JF7;7:JF8

2.3序列分析結(jié)果

圖3 EAV生物進(jìn)化樹

圖4 ART-CH核苷酸序列生物進(jìn)化樹

圖5 ev基因座核苷酸序列生物進(jìn)化樹分析

圖6 ev/J env基因核苷酸序列生物進(jìn)化樹

測(cè)序結(jié)果Lasergene分析顯示，江漢雞、靈山麻雞雞胚中EVA的TM和LTR之間區(qū)域的核酸序列相互之間的同源性為71.7%，與EAV-0內(nèi)源性序列的同源性分別為97.9%、70.9%；與E51內(nèi)源性序列的同源性分別為71.3%、94.2%。這表明江漢雞EAV與EAV-0同源性較高，而靈山麻雞EAV與E51同源性較高。核酸序列進(jìn)化樹見圖3。

核酸對(duì)比分析顯示，江漢雞、靈山麻雞中ART-CH的gag核酸序列部分之間的同源性為93.8%，與基因庫中已知的ART-CH5核酸序列同源性為91.2%，而與ART-CH14核酸序列的同源性僅為56.2%，2個(gè)品系雞胚細(xì)胞中ART-CH的gag核酸序列部分相比ART-CH14有大量的缺失，進(jìn)化樹分析見圖4。

江漢雞、靈山麻雞ev基因座中env基因之間的同源性為99.8%～100%，二者與ev基因座的原型株有Clone1，Clone3，Clone6同源性為98.2%～99.0%，其中與原型株ev-1的同源性高達(dá)99.2%，而與原型株ev-6的同源性較低，為98.2%。ev基因座的env基因核酸序列進(jìn)化樹分析見圖5。

江漢雞、靈山麻雞中ev/J的env基因部分片段的核酸序列之間具有高度的同源性，為98.1%，與其他已知ev/J序列EAV-HP、SD9901、YZ9901的同源性為94.7%～100%。2個(gè)品系雞胚細(xì)胞中ev/J的env基因核酸與外源性ALV-J標(biāo)準(zhǔn)株HPRS-103env基因核酸有高度同源性，為97.6%～98.1%。在2個(gè)品系雞胚細(xì)胞中檢測(cè)到的ev/J基因與其他已知的ev/J構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖6。

3 討論

內(nèi)源性禽白血病病毒是存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復(fù)制的前病毒DNA序列，主要包括CR1、ev基因座、EAV和ART-CH4類[1-2]。研究認(rèn)為內(nèi)源性病毒序列在外源性禽白血病病毒變異進(jìn)化中具有潛在的重要作用，尤其是ev/J，其與ALV-J的env基因同源性高達(dá)90%以上，因此通常認(rèn)為病毒新亞群ALV-J是由ev/J與ALV其他亞群發(fā)生基因重組而產(chǎn)生[6-8]。

本研究利用特異性引物對(duì)湖北省重要雞群江漢雞和靈山麻雞雞胚中的內(nèi)源性禽白血病病毒序列進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)2個(gè)品系的雞基因組中均存在4個(gè)類型的內(nèi)源性禽白血病病毒，并且不盡相同。

EAV核酸序列分析顯示，江漢雞和靈山麻雞EAV與EAV-0、E51等已知EAV的相應(yīng)區(qū)域核酸同源性在70.9%～97.9%之間，但是江漢雞EAV與EAV-0同源性較高，而靈山麻雞EAV與E51同源性較高，同源性分別為97.9%、94.2%。這與EVA感染原雞屬物種形成前的生殖細(xì)胞而存在于所有的原雞屬物種是一致的。但是，EAV群中不同的成員可能是在不同時(shí)期感染進(jìn)入原雞屬的，例如，E51和E33可能比EAV-0更加原始[1,6]。因此，對(duì)于從湖北省重要雞群，EAV感染進(jìn)入靈山麻雞可能進(jìn)入感染進(jìn)入江漢雞要早，靈山麻雞EAV與E51在進(jìn)化樹上位于同一分支。

ATR-CH序列分析顯示，江漢雞和靈山麻雞ATR-CH序列之間聯(lián)系緊密，同源性98.2%以上，但是二者與ATR-CH5(同源性91.0%)和ATR-CH14(56.2%)有較大的差別，特別是相比較ATR-CH14存在大的缺失。進(jìn)化樹樹分析可知，江漢雞與靈山麻基因組ATR-CHs與ATR-CH5、ATR-CH14處于不同的分支。

江漢雞、靈山麻雞的ev基因座和其他已知的e基因座中的env基因部分片段的核苷酸序列對(duì)比較，表明它們之間有較高的一致性。2個(gè)品系雞的ev基因座與ev-1原型株相關(guān)性最高，特別是靈山麻雞。進(jìn)化樹分析顯示，靈山麻雞的ev基因座與ev-6原型位于同一分支上，且與ev-3、ev-6的相關(guān)性高于江漢雞，表明了靈山麻雞中的ev基因座的進(jìn)化路徑與ev原型較江漢雞中的ev基因組更為接近。

核酸序列分析顯示，江漢雞、靈山麻雞中的ev/J中的env基因核苷酸序列之間以及與其他已知內(nèi)源性ev/J基因的核苷酸序列有很高的同源性。被檢測(cè)的2個(gè)品系雞中ev/J的env基因部分與已知的ev/J序列EAV-HP的同源性為100%。進(jìn)化樹分析，江漢雞、靈山麻雞中的ev/J基因和其他已知內(nèi)源性ev/J基因的核苷酸序列及外源性ALV-J標(biāo)準(zhǔn)株HPRS-103env基因核苷酸序列之間無明顯的分支，這與外源性ALV-J可能是通過ev/J與其他外源性病毒重組進(jìn)化而來的觀點(diǎn)相一致。

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2013-01-18

溫凌子(1988-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物病原微生物學(xué)。

楊玉瑩，E-mail:yangyycn@gmail.com。

S852.65+7

A

1673-1409(2013)05-0049-04