崔景軍，何嬌君，李 晶，杜元灝

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

腦血管疾病是威脅人類健康的一大難題，隨著科學的進步和臨床醫(yī)療水平的提高，腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究不斷向更高端更深入的層次發(fā)展，對于以動物實驗為基礎(chǔ)的研究，穩(wěn)定、可靠的動物模型制備和準確的評定標準是保證實驗科學性的前提。本實驗通過神經(jīng)行為學評分法、多普勒經(jīng)顱血流測量法和 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法相互驗證，探討大鼠大腦中動脈梗死（MCAO）模型成功的評價標準選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 5~6周齡Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量190～200 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。根據(jù)隨機數(shù)字表法分為1、2、3、6、9、12、15、18、21、24h10 個時相組，每組 6只。

1.2 儀器與試劑 激光多普勒血流儀（MoorInstruments，DRT－4），牙科鉆，小動物腦立體定位儀，恒流泵（滬西 BT－100），孵育箱，數(shù)碼照相機（Canon IXUS130），10%水合氯醛溶液，TTC（Amresco原裝進口），10%甲醛溶液。

1.3 術(shù)前準備 線栓為直徑0.20 mm魚線，緊繞在載玻片上，置于孵育箱80℃，1 h。切割后砂紙上打磨，顯微鏡下觀察斷端圓鈍，包被石蠟成水滴狀，浸漬多聚賴氨酸，游標卡尺測量并標記刻度，分別為18、20、22 mm。

10%水合氯醛，3.5 mL/kg，大鼠腹腔注射，麻醉，俯臥位固定，手術(shù)常規(guī)操作，沿頭皮正中縱向2 cm切口，分離皮下組織，剝離骨膜，暴露冠狀縫及矢狀縫，以冠狀縫與矢狀縫結(jié)合點為原點，冠狀縫向后4 mm，矢狀縫旁開3 mm，定位后用牙科鉆將顱骨磨薄，作為多普勒激光探頭測量位點，測量并記錄造模前雙側(cè)局部腦血流量基值。

1.4 MCAO模型制備 參照Koizumi線栓法[1]，大鼠仰臥位固定，手術(shù)常規(guī)操作，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）及頸外動脈（ECA）分別掛線，動脈夾暫時夾閉CCA和ECA，用眼科剪在CCA距分叉近心端3 mm處剪45°切口，插入線栓約18 mm，手感到阻力時停止。結(jié)扎CCA、ECA，固定線栓、縫合，測量造模后雙重局部腦血流量。

1.5 灌注、取材、TTC染色[2]經(jīng)3人分別盲法對大鼠進行神經(jīng)行為學評估并擬定評分后，大鼠10%水合氯醛腹腔深度麻醉（3.5 mL/kg），迅速開胸、開腹暴露心臟、腹主動脈，左心室穿刺插管作為灌注液流入口，剪開右心耳作為灌注液流出口，夾閉胸腹主動脈，5 min內(nèi)經(jīng)左心室快速灌注37℃生理鹽水l00 mL沖洗。迅速斷頭取腦，取大鼠視交叉后的腦組織，置-20℃冰凍20 min，至半硬狀態(tài)。自額葉由前向后作冠狀切片（厚2 mm）5等份，腦片放入2%TTC染液中，37℃避光染色20min，每隔5min翻動1次。濾除TTC染液，置于10%甲醛溶液中固定保存。

2 納入排除標準

2.1 Longa 5分制評分標準 0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀。1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（不能完全伸展右側(cè)前肢，左側(cè)Horner’s征陽性）。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（提尾懸空時右前肢屈曲、內(nèi)收，行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失（站立不穩(wěn)，向右側(cè)傾倒）。4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低[3]。評分在1～3分為造模成功。

2.2 激光多普勒腦血流測量納入排除標準 成功模型：大鼠術(shù)后即刻局部腦血流量下降至同側(cè)梗死前測定值的35%以下。以下3種情況為失敗模型：?。㎝CAO后即刻同側(cè)腦皮質(zhì)血流量下降，但高于梗死前測定值的35%。ⅱ）MCAO后即刻對側(cè)腦血流量出現(xiàn)急劇下降，提示蛛網(wǎng)膜下腔出血。ⅲ）實驗結(jié)束后取腦時見有頸內(nèi)動脈分叉部出血的。

3 結(jié)果

神經(jīng)行為學評分見表1。0分3只，TTC染色陽性1只。1分14只，TTC染色陽性9只。2分35只，TTC陽性34只，其中取腦時見有頸內(nèi)動脈分叉處出血6只。3分5只，TTC染色陽性5只，其中1只取腦時見有頸內(nèi)動脈分叉處出血。4分1只，TTC染色陽性，取腦時見蛛網(wǎng)膜下腔出血。

表1 神經(jīng)行為學評分、激光多普勒腦血流測量、TTC染色結(jié)果Tab.1 Results of neuroethology scores,Laser Doppler cerebral blood flow measurement,TTC staining

60只大鼠，麻醉后死亡1只，造模后死亡1只，其余58只MCAO大鼠，經(jīng)解剖和TTC染色驗證，神經(jīng)行為學評分法對44只MCAO大鼠模型判讀準確，準確率為75.86%，結(jié)合解剖結(jié)果，準確率為86.21%。多普勒腦血流量檢測法對51只模型MCAO大鼠模型判讀準確，準確率為87.93%。結(jié)合解剖結(jié)果，準確率為100%。

4 討論

大腦中動脈供血范圍的腦缺血是臨床最常見的腦缺血類型，大鼠線栓法MCAO模型制備不開顱、對動物生理功能影響小、梗死效果確切、重復性好、能準確控制缺血及再灌注時間，成為目前研究大鼠MCAO腦缺血的最廣泛方法。本課題組采用本法進行了多項研究[4-5]。但因大鼠個體差異、線栓插入深度均會明顯影響模型的成功率，因此，適宜的模型評價標準對后續(xù)實驗的科學性、準確性極其重要。

本實驗麻醉采用10%水合氯醛300～350 mg腹腔注射，麻醉起效時間3～5 min，麻醉維持時間30～70 min。采用Longa神經(jīng)功能缺損評分，尤其是對于腦梗死超急性期模型行為學觀察的判斷，可能會受大鼠的個體差異影響麻醉的蘇醒狀態(tài)，使準確率降低。TTC是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白，1958年開始用TTC染色檢測哺乳動物組織的缺血梗死[6]。TTC的不著色表明細胞進入膜衰竭即不可逆階段，能反映腦組織中梗死灶的具體情況[7]。研究表明，在永久閉塞非灌流性大腦中動脈缺血模型上，腦血流的阻斷可能呈漸進性過程，梗死體積將隨時間而增大[8]。TTC染色法在8 h以后大鼠腦梗死模型腦梗死組織的計算標記與體積測量中，得到了普遍應用[9]。但超早期大腦中動脈梗阻后，半暗帶的神經(jīng)細胞尚未處于膜衰竭期[10]，不同區(qū)域的腦組織對缺血的敏感性可影響梗死灶出現(xiàn)的最早時間點，從而影響TTC染色對超早期的大腦中動脈梗死模型判讀的準確性。另外，已經(jīng)進行TTC染色的腦組織，會影響進一步檢測基因和蛋白的表達變化結(jié)果，不適用于后續(xù)有對腦組織生物活性要求較高的檢測和實驗。

本研究結(jié)果顯示，激光多普勒血流測量法對大腦中動脈梗死模型是否成功的判斷具有良好的敏感性和準確性，尤其適用于超急性期大腦中動脈梗死模型選用。選擇適合的腦梗死模型納入排除標準，才能在進一步的實驗中更真實的再現(xiàn)大鼠腦缺血生理病理變化，更如實反映指標數(shù)據(jù)，增強可信度，才能使筆者在腦缺血動物模型基礎(chǔ)上所得到的研究結(jié)論達到真正意義上的嚴謹和可信。

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