乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化活性*

王瑜，周春生，劉書云，田然，田雨，姜瞻梅

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150030)

糖基化反應(yīng)，是一種氨基化合物和羰基化合物之間發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)，與化學(xué)修飾相比較，糖基化反應(yīng)為食品和藥品系統(tǒng)提供了更安全的接枝物，這種酶法修飾蛋白質(zhì)可以用于改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、乳化性、溶解性［1］。Jimenez-Castano［2］等將葡聚糖引入到β-乳球蛋白中可改善β-乳球蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性;Chevalier［3］等將乳糖引入到β-乳球蛋白中可提高乳清蛋白的起泡性;Li［4］等發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白麥芽糖的糖基化產(chǎn)物具有顯著的凝膠形成特性。

菊粉是由D-果糖經(jīng)β(1-2)糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖，是一種非消化性的碳水化合物，含有大量游離氨基，它不僅能夠改善食品質(zhì)構(gòu)，提高流變學(xué)性質(zhì)和營養(yǎng)特性，而且可以作為氨基的供應(yīng)體與還原糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，對于菊粉糖基化反應(yīng)的研究目前集中在乳化性方面［5］，而抗氧化性方面的研究較少。本研究擬利用糖基化修飾技術(shù)，以乳清蛋白和菊粉為研究對象，制備乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物，探討糖基化反應(yīng)條件對乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化性能的影響，為拓展糖基化蛋白改性和提供天然的抗氧化劑提供基本技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白分離物(WPI)，北京Milky Way 商業(yè)公司;菊粉，定西市隴海乳品有限責(zé)任公司;2，2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH)，美國sigma公司;鐵氰化鉀，天津市博迪化工有限公司;過硫酸鉀，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;三氯化鐵，天津市雙船化學(xué)試劑廠;三氯乙酸，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

pH 計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;GL-21M 離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所;精密電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UT-1800 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;DK-8B 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;電子恒溫油浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白糖基化復(fù)合物的制備

將乳清蛋白與菊粉按照一定的比例混合、溶解，在一定溫度和pH 值下于具塞離心管中油浴反應(yīng)，并測定反應(yīng)后pH 值，反應(yīng)產(chǎn)物在－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 褐變程度的測定

參考Ajandouz［6］等人的方法，并稍作修改。將不同濕熱反應(yīng)條件下制備的樣品用蒸餾水稀釋4 倍，在420 nm 處測定其吸光值變化。

1.2.3 DPPH·清除能力的測定

參考Saiga［7］的方法，并稍作修改。取稀釋4 倍的樣品液1.0 mL(0.01 mol/L pH 值為7 的磷酸鹽緩沖液稀釋)及4.0 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，混合均勻，室溫下避光靜置0.5 h，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液作參比，在517 nm 測定吸光度Ai，95%的乙醇代替樣品溶液，得吸光度Ac，95%的乙醇代替DPPH 溶液，得吸光度Aj。

1.2.4 還原能力測定

參考Oyaizu［8］的方法，并稍作修改。取0.5 mL的2 倍稀釋樣品(0.01 mol/L pH 值為7 的磷酸鹽緩沖液稀釋)，加入2.5 mL 的0.2 mol/L，pH 值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 的1%的K3Fe(CN)6溶液混合均勻，將混合物于50℃下保溫20 min 后快速冷卻，再加入2.5 mL 的10%的三氯乙酸溶液，混勻后再3 000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 的蒸餾水和0.5 mL 的0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min 后，在700 nm 處測定吸光值。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別研究不同反應(yīng)物濃度(2%、4%、6%、8%、10%)，反應(yīng)溫度(80℃、90℃、100℃、105℃、110℃)，反應(yīng)起始pH 值(7、8、9、10、11、12)對乳清蛋白糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化活性的影響，并對乳清蛋白糖基化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 軟件，進(jìn)行方差分析(Dundan 多重比較)和獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=4)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.1.1 反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響

棕褐色的生成(420 nm)是最容易衡量的糖基化反應(yīng)的結(jié)果，因?yàn)樗峁┝艘粋€可視化估計(jì)(Morales＆ Jimenez-Perez，2001)［9］。420 nm 處的吸光值在一定程度上反映了糖基化反應(yīng)程度的大小，吸光值越大，說明其反應(yīng)程度越大，反之則較小。將乳清蛋白與菊粉按1 ∶1 配制成2%、4%、6%、8%、10%的溶液，在100℃，起始反應(yīng)pH 值9 條件下反應(yīng)6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物。反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響Fig.1 The effect of reactant concentration on browning intensity of glycosylated WPI

從圖1 的T 檢驗(yàn)結(jié)果可知，糖基化乳清蛋白與單獨(dú)加熱的乳清蛋白相比，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)，這說明糖基化反應(yīng)可使乳清蛋白發(fā)生褐變反應(yīng)，色澤變深。由方差分析的試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)加熱后的乳清蛋白和糖基化乳清蛋白的褐變強(qiáng)度，隨反應(yīng)物濃度增加，逐漸增大(P＜0.05)，這表明增加反應(yīng)物濃度，可增強(qiáng)乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度。

2.1.2 反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響

本文評價(jià)乳清蛋白糖基化復(fù)合物的抗氧化活性，主要包括DPPH 自由基清除能力和還原能力的兩個方面。反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 反應(yīng)物濃度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響Table 1 The effect of reactant concentration on antioxidant property of glycosylated WPI

從表1 中T 檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果可知，與單獨(dú)加熱乳清蛋白相比，當(dāng)反應(yīng)物濃度為6%、8%、10%時(shí)，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力和還原能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。

由表1 中方差分析試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)加熱乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力隨著反應(yīng)物濃度的增加，略微增大;然而，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力，隨著反應(yīng)物物濃度增加，其顯著增大(P＜0.05)。當(dāng)反應(yīng)物濃度為10%時(shí)，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的DPPH·清除率是反應(yīng)物濃度為2%時(shí)的4.5 倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)加熱乳清蛋白的自由基清除能力。這可能是糖基化蛋白可通過提供氫，使得DPPH·形成穩(wěn)定的DPPH-H 分子，從而達(dá)到清除DPPH·的目的(Matthaus)［10］。由此，可推斷乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物能夠有效的為自由基提供氫，是自由基抑制劑，可以作為抗氧化劑。

單獨(dú)加熱乳清蛋白的還原能力變化差異不顯著(P＞0.05)，而乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的還原能力隨著反應(yīng)物濃度升高，其顯著增大(P＜0.05)。反應(yīng)物濃度為10%時(shí)的乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的還原能力是反應(yīng)物濃度為2%的3 倍。

綜合上述結(jié)果表明，增加反應(yīng)物濃度可有效提高乳清蛋白糖基化復(fù)合物的抗氧化活性。

2.2 溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.2.1 溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響

在糖基化反應(yīng)中，溫度相差10℃，褐變速度就可相差3 ～5 倍。將乳清蛋白與菊粉按1∶1 比例配制成6%的溶液，調(diào)節(jié)起始反應(yīng)pH 值為9，分別在80℃、90℃、100℃、105℃、110℃條件下反應(yīng)6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物。反應(yīng)溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響Fig.2 The effect of temperature on browning intensity of glycosylated WPI

從圖2 的T 檢驗(yàn)結(jié)果可知，不同反應(yīng)溫度條件下的糖基化乳清蛋白與單獨(dú)加熱的乳清蛋白相比，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)。從圖2 中方差分析的試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)加熱后的乳清蛋白和糖基化乳清蛋白在420 nm 處的吸光值，隨著反應(yīng)溫度升高而緩慢增加(P＞0.05)，可能是由于溫度的升高，可促進(jìn)羰氨縮合反應(yīng)，使得生成的褐色物質(zhì)增加，但由于多糖反應(yīng)較慢，只有較少量的中間產(chǎn)物形成了褐色物質(zhì)，這表明升高反應(yīng)溫度可增強(qiáng)糖基化反應(yīng)的褐變程度，但影響程度較小。

2.2.2 溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響

溫度是糖基化反應(yīng)的重要影響因素，可以影響還原酮，類黑精等抗氧化物質(zhì)的生成。溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性影響的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 溫度對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響Table 2 The effect of temperature on antioxidant property of glycosylated WPI

從表2 中T 檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果可知，與單獨(dú)加熱乳清蛋白相比，當(dāng)溫度超過100℃后，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力及還原能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。

由表2 中方差分析試驗(yàn)結(jié)果可知，糖基化乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力隨溫度升高呈上升趨勢，在90℃時(shí)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，單獨(dú)加熱乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力在90℃、105℃時(shí)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，這與Manzocco 等在許多反應(yīng)模式中發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)溫度與抗氧化性呈現(xiàn)正相關(guān)的研究結(jié)果一致［11］。

乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的還原能力隨溫度升高而緩慢增加(P＜0.05)，而單獨(dú)加熱乳清蛋白的還原能力對不同反應(yīng)溫度變化，其差異不顯著(P＞0.05)。這可能是因?yàn)樘岣叻磻?yīng)溫度可以促進(jìn)糖基化反應(yīng)產(chǎn)生還原酮和一系列雜環(huán)化合物，還原酮物質(zhì)具有還原和螯合作用，雜環(huán)類化合物之間具有相互締合和協(xié)同作用，這對抗氧化活性有很大的作用。

綜合所述可知，升高反應(yīng)溫度，可以提高乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的抗氧化性。

2.3 起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.3.1 起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響

較高起始反應(yīng)pH 值有助乳清蛋白與菊粉發(fā)生糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致褐變。將乳清蛋白與菊粉按1:1 比例配制成6%的溶液，分別調(diào)節(jié)起始反應(yīng)pH 值為7、8、9、10、11、12，在100℃下反應(yīng)6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物。起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

從圖3 的T 檢驗(yàn)結(jié)果可知，糖基化乳清蛋白與單獨(dú)加熱乳清蛋白相比，除起始反應(yīng)pH 值8 以外，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)，說明不同反應(yīng)條件下的糖基化反應(yīng)，對乳清蛋白褐變程度影響較大。同時(shí)，由方差分析的試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)加熱乳清蛋白，在起始反應(yīng)pH 值8 ～11 范圍內(nèi)，420 nm 處的吸光值差異不顯著(P＞0.05);糖基化乳清蛋白，隨起始反應(yīng)pH 值的升高逐漸增大，在起始反應(yīng)pH 值為10、11、12 時(shí)，420 nm 處的吸光值差異顯著(P＜0.05)，由此可知，堿性條件有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，這與Moreno 等在葡萄糖—賴氨酸體系中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致［12］。

圖3 起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響Fig.3 The effect of initial pH on browning intensity of glycosylated WPI

2.3.2 起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響

褐色素的形成和抗氧化活性有很大的關(guān)聯(lián)，因此，起始反應(yīng)pH 值會對糖基化蛋白的抗氧化活性產(chǎn)生影響。起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 起始反應(yīng)pH 值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物抗氧化活性的影響Table 3 The effect of initial pH on antioxidant property of glycosylated WPI

從表3 中T 檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)起始反應(yīng)pH值7 ～10 范圍內(nèi)，與單獨(dú)加熱乳清蛋白相比，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05);在起始反應(yīng)pH 值7 ～12 范圍內(nèi)，乳清蛋白菊粉糖基化復(fù)合物的還原能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。

由表3 中方差分析試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)加熱乳清蛋白和乳清蛋白菊粉糖基化蛋白的DPPH 自由基清除能力，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。這可能由于氨基酸是兩性分子，它在堿性介質(zhì)中呈陰離子，此時(shí)，氨基反應(yīng)性較強(qiáng)，易發(fā)生反應(yīng)，因此起始反應(yīng)pH 值偏向堿性有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，但是堿性過強(qiáng)，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，如脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起“胱賴反應(yīng)”，將氨基酸轉(zhuǎn)變成有毒的化合物，反而不利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。

在起始反應(yīng)pH10 ～12，單獨(dú)加熱乳清蛋白的還原能力逐漸增大(P＜0.05)，而糖基化乳清蛋白的還原能力，隨著起始反應(yīng)pH 值增大而顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。起始反應(yīng)pH 值為7 時(shí)，糖基化乳清蛋白的還原能力最低，可能由于還原酮及裂變產(chǎn)物在較高的pH 值條件下更容易形成［13］。

3 結(jié)論

在乳清蛋白糖基化反應(yīng)過程中，反應(yīng)物濃度越大，反應(yīng)溫度越高，乳清蛋白菊粉糖基化產(chǎn)物的褐變強(qiáng)度越大，抗氧化活性越強(qiáng);起始反應(yīng)pH 值越大，乳清蛋白菊粉糖基化產(chǎn)物的褐變強(qiáng)度及還原能力越強(qiáng)，而其DPPH 自由基清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)反應(yīng)物濃度為6%，溫度為100℃，起始反應(yīng)pH 值為9 時(shí)，所獲得的乳清蛋白糖基化產(chǎn)物抗氧化活性較強(qiáng)。乳清蛋白與菊粉的糖基化反應(yīng)是一種具有應(yīng)用前景的改善乳清蛋白抗氧化活性的方法，其糖基化產(chǎn)物可以作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

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