金磊，張紀(jì)元，孫紅啟，王立峰，張政，王福生

感染乙肝病毒(HBV)的人群中有10%～20%將發(fā)展成肝硬化，宿主免疫應(yīng)答對(duì)乙肝肝硬化患者的疾病進(jìn)展具有重要作用[1-4]。肝內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，一方面可直接誘導(dǎo)肝損傷發(fā)生，另一方面可通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸、促炎細(xì)胞因子的分泌以及金屬蛋白酶等誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的活化或死亡[5-8]，從而加快或延緩肝臟纖維化。Th17細(xì)胞(IL-17+CD4+T細(xì)胞)是最近被鑒定的促炎癥細(xì)胞亞群[9]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者肝內(nèi)浸潤(rùn)的Th17細(xì)胞一方面通過(guò)分泌IL-17招募炎性細(xì)胞到達(dá)肝臟，另一方面直接激活肝內(nèi)天然免疫細(xì)胞，造成持續(xù)的慢性炎癥[10]。本研究探討Th17細(xì)胞與乙肝肝硬化患者疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，以及IL-17在疾病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2008年7月－2011年12月在解放軍302醫(yī)院診治的乙肝肝硬化患者60例，年齡48.0±10.2(38～75)歲，入選患者未接受過(guò)抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療或激素治療，所有患者在過(guò)去6個(gè)月內(nèi)無(wú)消化道出血、肝腎綜合征、肝性腦病、細(xì)菌感染、自發(fā)性腹膜炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。排除使用過(guò)微生態(tài)制劑、諾氧氟沙星的患者及肝癌患者?；颊咴谌脒x時(shí)計(jì)算Child-Pugh評(píng)分[11]。同時(shí)入選2010年6月解放軍302醫(yī)院健康體檢中心的30名年齡匹配的健康人(health controls，HC)作為對(duì)照。本研究獲解放軍302醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書(shū)，研究對(duì)象臨床資料見(jiàn)表1。

表1 入選研究對(duì)象臨床資料比較Tab.1 Clinical data of enrolled subjects

1.2 Th17細(xì)胞頻率及IL-17R檢測(cè) 藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗人IL-17(美國(guó)eBscience公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人IL-17R(美國(guó)R&D Systems公司)；其他抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。取200μl新鮮肝素抗凝外周血，在800μl含10%胎牛血清(FCS)、300μg/ml佛波酯(PMA)和1μg/ml離子霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中孵育5h；加入0.4μmol/L莫能菌素再孵育1h，行胞內(nèi)IL-17染色。根據(jù)文獻(xiàn)[10]中的操作方法，采用FACSTM裂解全血并進(jìn)一步破膜，加入相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)抗體染色，固定。按照抗體使用說(shuō)明書(shū)，采用FITC標(biāo)記的抗人IL-17R抗體和同型抗體對(duì)膜表面的IL-17R進(jìn)行染色標(biāo)記。采用FACS Calibur和FlowJo軟件進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3 IL-17水平檢測(cè) 按照IL-17 ELISA定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)eBscience公司)操作說(shuō)明，對(duì)血漿中IL–17A水平進(jìn)行檢測(cè)。該ELISA試劑盒的最小檢測(cè)濃度為15pg/ml。批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別＜5%和＜10%。所有樣品均進(jìn)行2次重復(fù)檢測(cè)。

1.4 LX-2細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-23p19的檢測(cè) 將人肝星狀細(xì)胞LX-2接種至24孔板[12]，待細(xì)胞全部貼壁展開(kāi)后，加入1ng/ml IL-17(美國(guó)R&D Systems公司)孵育24h，分別收集上清及細(xì)胞，取上清檢測(cè)上述細(xì)胞因子，取細(xì)胞進(jìn)行流式抗體染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)α-SMA的表達(dá)。以不加IL-17的細(xì)胞作為對(duì)照。IL-6、IL-8和IL-23p19的測(cè)定采用ELISA法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同組間的多重比較采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血Th17細(xì)胞頻率檢測(cè) 乙肝肝硬化患者Th17細(xì)胞頻率明顯高于健康人(P＜0.01)，且隨乙肝肝硬化病情的加重進(jìn)一步升高，肝硬化Child分級(jí)C級(jí)患者體內(nèi)Th17頻率最高，與Child A級(jí)患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 外周血IL-17水平檢測(cè) 與健康人相比，乙肝肝硬化患者血漿IL-17濃度顯著升高(P＜0.05)，但在不同分級(jí)的乙肝肝硬化患者之間無(wú)明顯差異(圖2)。

圖1 外周血Th17細(xì)胞頻率檢測(cè)Fig.1 Detection of Th17 cells frequency in peripheral blood

圖2 外周血IL-17濃度檢測(cè)Fig.2 Detection of IL-17 concentration in peripheral blood

2.3 IL-17對(duì)肝星狀細(xì)胞的作用 由圖3可見(jiàn)，IL-17刺激后，LX-2細(xì)胞IL-17R表達(dá)上調(diào)，α-SMA的表達(dá)也明顯上調(diào)，且產(chǎn)生了炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-23p19(圖4)。

3 討 論

圖3 IL-17R在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)(×400)Fig.3 Expression of interleukin(IL)-17R in LX-2 cells(×400)

圖4 IL-17激活對(duì)體外LX-2細(xì)胞的作用Fig.4 Effect of IL-17 activation on LX-2 cells in vitro

Th17細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的CD4輔助性T細(xì)胞的一個(gè)亞群，可分泌細(xì)胞因子IL-17。IL-17家族有6個(gè)成員(A、B、C、D、E、F)和5種受體(RA、RB、RC、RD、RE)，其中最緊密相關(guān)的兩個(gè)成員是IL-17和IL-17F。IL-17在對(duì)抗特異性病原體的感染中具有重要作用。在針對(duì)某些病原體的免疫應(yīng)答中，尤其是在抗革蘭陰性菌和抗真菌感染中，IL-17除了可以通過(guò)募集單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞促進(jìn)炎癥外，還可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步激活和放大促炎癥效應(yīng)。

目前的證據(jù)顯示，Th17細(xì)胞參與了各種肝臟疾病的炎癥進(jìn)程，包括酒精性肝損傷、非酒精性肝炎、病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎等[10,13-14]。然而，Th17細(xì)胞在乙肝肝硬化中的作用尚不十分清楚。本研究測(cè)定了Th17細(xì)胞在乙肝肝硬化患者中的頻率，發(fā)現(xiàn)外周血內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量的增加與乙肝肝硬化的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，并且Th17細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17在患者外周血內(nèi)也是顯著增加的。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，慢性乙肝患者外周血內(nèi)Th17細(xì)胞的數(shù)量及Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-23、IL-1β、IL-17等)水平明顯升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)升高的Th17細(xì)胞頻率與患者ALT水平、病毒載量呈明顯正相關(guān)。重要的是，慢性乙肝患者肝臟中Th17細(xì)胞大量浸潤(rùn)，與肝臟病理分級(jí)呈顯著正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17能激活單核細(xì)胞和mDC細(xì)胞，并能促進(jìn)二者分泌大量促炎癥細(xì)胞因子。上述研究提示，Th17細(xì)胞在慢性乙肝患者的肝臟損傷中起著重要作用，可通過(guò)激活表達(dá)IL-17R的天然免疫細(xì)胞來(lái)加劇肝臟的炎癥和損傷[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，人肝星狀細(xì)胞系LX-2可表達(dá)IL-17R，且在受到IL-17刺激后被激活并能分泌IL-6、IL-8和IL-23p19，提示Th17細(xì)胞可通過(guò)IL-17/IL-17R信號(hào)途徑直接激活肝星狀細(xì)胞，從而加速肝纖維化的進(jìn)程，另一方面激活的肝星狀細(xì)胞可通過(guò)分泌促炎癥因子進(jìn)一步加劇肝臟的炎癥。

綜上所述，本研究提示Th17細(xì)胞對(duì)于肝臟纖維化和肝硬化后的疾病進(jìn)展具有促進(jìn)作用，并可作為預(yù)測(cè)肝硬化患者疾病進(jìn)程的免疫學(xué)標(biāo)志。這些發(fā)現(xiàn)拓展了對(duì)Th17細(xì)胞在肝臟疾病中作用的認(rèn)識(shí)，有助于后續(xù)的干預(yù)措施及治療靶點(diǎn)研究。

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