張三鳳，趙 健，朱長軍，董智雄

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點(diǎn)實驗室，天津 300387）

肺癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，也是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，近年來該病的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的治療進(jìn)入了分子靶向治療的新階段，分子靶向治療已全面融入到了肺癌治療的各個階段.根據(jù)不同患者肺癌組織分子生物學(xué)方面的改變，制定個體化的治療方案將是今后的研究重點(diǎn).因此，尋找新的腫瘤分子標(biāo)記物用于肺癌的診斷和治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1-3].

細(xì)胞染色體中，非整倍體以及染色體的不穩(wěn)定性源于有絲分裂過程中染色體的錯誤分離，常常會引起腫瘤的發(fā)生[4].紡錘體微管和著絲粒DNA 的準(zhǔn)確連接對于染色體的正確分離至關(guān)重要，這個過程需要許多與紡錘體和著絲粒微管動力學(xué)有關(guān)的驅(qū)動蛋白參與[5].KIF4A 是一種染色體結(jié)合驅(qū)動蛋白（chromokinesin），也是一種多功能動力蛋白分子，它參與有絲分裂過程中紡錘體的形成[6]、染色體的凝集與分離[7]、DNA 的損傷應(yīng)答[8]和細(xì)胞骨架的動態(tài)不穩(wěn)定性[9]等.KIF4A 蛋白分子的功能多樣性使其與人類各種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).Mazumdar 等[10]檢測KIF4A 在NCI-60（含有60 種不同人腫瘤細(xì)胞株）腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)35%的細(xì)胞株KIF4A 蛋白低表達(dá)或無表達(dá)，繼而應(yīng)用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)KIF4A 無表達(dá)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞染色體超凝集化并呈現(xiàn)染色體非整倍體，在裸鼠體內(nèi)植入該胚胎干細(xì)胞后可以形成腫瘤，這充分表明KIF4A 與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).Taniwaki 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中KIF4A 的mRNA 表達(dá)量高于正常組織.基于這些研究，推測KIF4A 可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系.

本課題組以β-Actin（肌動蛋白）為內(nèi)參，采用實時定量PCR 的方法檢測肺癌組織和正常肺組織中KIF4A mRNA 表達(dá)水平的差異，分析其表達(dá)量與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的關(guān)系，為進(jìn)一步研究KIF4A 與肺癌的發(fā)生發(fā)展、臨床特征指標(biāo)的相關(guān)性奠定基礎(chǔ).

1 實驗材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

31 例肺癌組織標(biāo)本和3 例正常肺組織標(biāo)本均由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院提供.其中，肺癌組織標(biāo)本來源于只接受了外科手術(shù)治療的肺癌病人，包括男性24 例，女性7 例，病人的年齡、性別、癥狀和病理學(xué)類型等都來源于臨床病理記錄.肺組織標(biāo)本在提取RNA 之前，均保存于液氮中.

1.2 試劑

氯仿、無水乙醇、異丙醇，天津科威公司生產(chǎn)；Trizol，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；IMProm-IIIM 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，美國Promega 公司生產(chǎn)；qRTPCR（SYBR Green）Kit，天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 提取

切取肺癌組織和正常的肺組織各0.1～0.2 g，分別加入1 mL Trizol，按試劑說明書中的操作步驟進(jìn)行RNA 提取，最后用DEPC 水進(jìn)行溶解，取2 μL測定其濃度，其余的放入-80 ℃下保存.

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR

取上述已測定濃度的RNA 2 μg，使用IMProm-IIIM 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA.反轉(zhuǎn)錄體系如下：

Ⅰ：RNA 2 μg、Oligo dT primer 1 μL、DEPC水，共11 μL，70 ℃水浴放置10 min，冰浴2 min.

Ⅱ：5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer 4 μL、dNTP 4 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，共9 μL，將Ⅱ加入Ⅰ中，共20 μL.

反轉(zhuǎn)錄循環(huán)設(shè)計：變性溫度95 ℃，時間為5 min；退火溫度42 ℃，時間為1 h；25 ℃下保溫10 min.

1.3.3 實時定量PCR（RT-PCR）

將上述反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 用4 倍體積的高壓去離子水稀釋，進(jìn)行實時定量PCR 實驗.其中β-Actin、KIF4A 的引物如下：

以1.3.2 中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，體系設(shè)計如下：

體系1（Actin）：水4 μL，primer1 2 μL，primer2 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

體系2（KIF4A）：水4 μL，primer3 2 μL，primer4 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

循環(huán)設(shè)計：第1 步，95 ℃、3 min；第2 步，95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，68 ℃、30 s.40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，熒光信號強(qiáng)度超過基線時，記錄其閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值），結(jié)果為3 次實驗的平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量.以正常肺組織作為對照，把對照組的表達(dá)量設(shè)為1，因此癌組織的表達(dá)量就是對照組該基因表達(dá)量的N 倍，比例代表肺癌組織與正常肺組織中KIF4A mRNA表達(dá)量的比值.采用SPSS 13.0 軟件分析各組間差異，進(jìn)行T 檢驗，P ≤0.05 時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 KIF4A 和β-Actin PCR 反應(yīng)溶解曲線

用實時定量PCR 方法檢測KIF4A mRNA 在標(biāo)本中的表達(dá)水平，KIF4A 和β-Actin 的溶解曲線如圖1 和圖2 所示，顯示二者基因PCR 產(chǎn)物的溶解曲線峰值都在88 ℃，溶解溫度均一，并且峰的形狀都較為銳利.這表明PCR 擴(kuò)增特異性較強(qiáng)，無明顯的引物二聚體或其他非特異性雜帶出現(xiàn).

2.2 肺癌組織和正常肺組織中KIF4AmRNA 的表達(dá)

如圖3 所示，KIF4A mRNA 在正常肺組織和肺癌組織中都有表達(dá)，且31 例肺癌組織中有29 例的KIF4A mRNA 表達(dá)水平高于正常組織，其中26 例（83.87%）比正常組織高2 倍以上，10 例（32.30%）比正常組織高4 倍以上.由此可見，肺癌組織中KIF4A mRNA 的表達(dá)水平顯著高于正常組織，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）.

2.3 肺癌組織中KIF4A mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析

肺癌組織標(biāo)本的檢測信息結(jié)果如表1 所示.從表中可以看出，在鱗癌與腺癌中，KIF4A mRNA 表達(dá)量的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.615，P=0.863）.KIF4A mRNA 的表達(dá)量與肺癌組織分化程度之間（F=1.214，P=0.882）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間（F=1.153，P=0.739）的差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義.但KIF4A mRNA 的表達(dá)量在TNM 分期之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，TⅡ中的表達(dá)量要顯著高于TⅠ中的表達(dá)量（F=0.565，P=0.029）.

表1 KIF4A mRNA 的表達(dá)量與肺癌各臨床特征之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of KIF4A mRNA and lung cancer clinicopathological characteristics

3 討論與結(jié)論

Taniwaki 等研究證實，采用RNAi（RNA 干涉）的方法沉默KIF4A 基因表達(dá)后，與正常細(xì)胞相比，肺癌細(xì)胞的生長受到明顯抑制[8]，這說明KIF4A 可能是肺癌細(xì)胞生長過程中一個重要的生長因子.本研究通過對肺癌組織和正常組織中KIF4A mRNA表達(dá)水平的檢測和比較，發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中KIF4A mRNA 的表達(dá)水平顯著高于正常組織，表明KIF4A mRNA 的表達(dá)量與肺癌的發(fā)生發(fā)展有明確的相關(guān)性.Taniwaki 等的研究進(jìn)一步證實KIF4A 的表達(dá)量對肺癌細(xì)胞的侵襲有一定的影響[8]，由此推測KIF4A可能通過影響細(xì)胞的侵襲功能而發(fā)揮致癌作用，但KIF4A 表達(dá)量增高的具體分子機(jī)制尚不清楚.臨床病理因素分析表明，KIF4A mRNA 的表達(dá)量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理組織類型和肺癌細(xì)胞分化程度的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，KIF4A mRNA 的表達(dá)量在TNM 分型中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在TⅡ中KIF4A mRNA 的表達(dá)量顯著高于TⅠ.而T 分型與病人的遠(yuǎn)期預(yù)測即存活率有關(guān)，意味著KIF4A 可能與肺癌的預(yù)后（存活可能概況）存在一定的相關(guān)性.

綜上所述，KIF4A 可能成為肺癌的新型標(biāo)記分子和治療靶標(biāo)，同時也可以作為其預(yù)后的標(biāo)志分子.

[1]王東秋，高杰，朱長軍，等.驅(qū)動蛋白分子KIF18A 各功能域細(xì)胞定位的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，48（5）：40—44.

[2]王東秋，黃婉蘭，林英誠.非小細(xì)胞肺癌分子預(yù)測標(biāo)位物[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2011，38（4）：278—281.

[3]朱文，周清華.肺癌篩查中的分子標(biāo)志物[J].中國肺癌雜志，2004，7（6）：538—541.

[4]TOMONAGA T，MATSUSHITA K，ISHIBASHI M，et al.Centromere protein H is up-regulated in primary human colorectal cancer and its over expression induces aneuploidy[J].Cancer Res，2005，65：4683—4689.

[5]BAKHOUM S F，THOMPSON S L，MANNING A L，et al.Genome stability is ensured by temporal control of kinetochore-microtubule dynamics[J].Nat Cell Biol，2009，11（1）：27—35.

[6]ZHU C J，JIANG W.Cell cycle-dependent translocation of PRC1 on the spindle by KIF4 is essential for midzone formation and cytokinesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（2）：343—348.

[7]MAZUMDAR M，SUNDARESHAN S，MISTELI T，et al.Human chromokinesin KIF4A functions in chromosome condensation and segregation[J].J Cell Biol，2004，166（5）：613—620.

[8]WU G，ZHOU L，KHIDR L，et al.A novel role of the chromokinesin KIF4A in DNA damage response[J].Cell Cycle，2008，7（13）：2013—2020.

[9]HU C K，COUGHLIN M，F(xiàn)IELD C M，et al.KIF4 regulates midzone length during cytokinesis[J].Curr Biol，2011，21（10）：815—824.

[10]MAZUMDAR M，LEE J H，SENGUPTA K，et al.Tumor formation via loss of a molecular motor protein[J].Curr Biol，2006，16（15）：1559—1564.

[11]TANIWAKI M，TAKANO A，ISHIKAWA N，et al.Activation of KIF4A as a prognostic biomarker and therapeutic target for lung cancer[J].Clin Cancer Res，2007，13（22）：6624—6631.