趙翠娟 ，宋文軍，朱高雄，魏紀平，李博志 宋瓘蘭，閆春燕，龔 忱

（1.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津市興源環(huán)境技術工程有限公司，天津 300384；3.天津清鑒生物科技有限公司，天津 300384）

氮循環(huán)是水體循環(huán)的重要組成部分，其中氨氮是造成水體污染的主要污染物之一，同時也是引起水體富營養(yǎng)化和減弱水體自凈能力的主要原因之一[1].因此，降解污水中的氨氮對維持水體清潔具有重要意義[2].生物脫氮技術作為去除污水中氮素污染的最有效方法成為水處理領域的一個研究熱點[3-5]，目前被認為是具有較高可行性和最有前途的水體脫氮方法.傳統(tǒng)的生物脫氮由硝化作用和反硝化作用共同完成[6]，硝化作用又包括2 個步驟：將氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽.這2個步驟分別由亞硝化細菌和硝化細菌完成[7-8]，這一領域的研究較多[9-11].硝化細菌在生物硝化脫氨中起主要作用，它直接影響硝化的效果和生物脫氨的效率[12].但僅采用傳統(tǒng)方法篩選硝化細菌還遠不能達到當前的社會需求，而且耗費時間長、效率低.因此，高效快速地篩選硝化細菌是目前急需解決的問題.

在此背景下，本課題組研究了一種新型的硝化細菌的篩選方法，該方法不但達到了快速篩選的目的，最重要的是還能高通量篩選硝化細菌，這對于后續(xù)的污水處理具有理論和現(xiàn)實意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

該研究的污水樣品取自天津市紀莊子污水處理廠的曝氣池，篩選出的菌株以“JZZ-”開頭、依次用阿拉伯數(shù)字1～100 對其進行命名，順序隨機而定，無特殊含義.氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的鑒定用氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽快速測定試劑盒測定，該試劑盒由北京蘭康保技術有限公司提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）硝化細菌富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO·47H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，C6H6O61.8 g，CaCO36.4 g，NaHCO30.078 g，微量元素Ⅰ（FeSO44 g，EDTA 4 g），微量元素Ⅱ（EDTA 1.2 g，ZnSO4·7H2O 0.52 g，CoCl·6H2O 0.25 g，MnCl20.724 g，CuSO4·5H2O 0.24 g，Na2MoO4·2H2O 0.32 g，NiCl·26H2O 0.18 g，H3BO30.016 g），蒸餾水1 000 mL，pH 值為8.0～8.2（用質(zhì)量分數(shù)5%的碳酸鈉和鹽酸調(diào)pH 值）.

（2）硝化細菌分離培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

（3）硝化細菌鑒定培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，CH3COONa 8 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

以上所用培養(yǎng)基若是固體培養(yǎng)基則加入質(zhì)量分數(shù)1.7%～2.0%的瓊脂，且都在115 ℃條件下滅菌25 min.

1.2 方法

1.2.1 細菌的馴化

取污水樣品100 mL 倒入三角瓶中，每隔6 h替換1 次人工培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基的量依次為0、20%、40%、60%、80%、100%，置于27 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng).

1.2.2 硝化細菌的初篩

將菌液進行梯度稀釋，選取3 個濃度梯度1.0×104、1.0×105、1.0×106涂布到固體分離培養(yǎng)基上（每個稀釋度做3 個重復），30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.再從涂布的平板上挑取菌落在固體分離培養(yǎng)基上進行劃線分純，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復此步驟，直到得到單菌落為止.以上操作均在無菌條件下進行.

1.2.3 硝化細菌的富集

用接種環(huán)將初篩的單菌落接種到裝有0.8 mL富集培養(yǎng)基的菌株富集管中，將菌株富集管蓋擰緊裝入凍存盒，再將其平放入搖床，30 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h.

1.2.4 高通量驗證硝化細菌

微孔板顯色鑒定法：取無菌的裝有鑒定培養(yǎng)基的96 孔深孔培養(yǎng)板，用排槍向每孔接入20 μL 富集菌液，28 ℃、150 r/min 下振蕩培養(yǎng)24 h，不加菌液的裝有鑒定培養(yǎng)基的孔作為空白對照組.

氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的快速測定方法：本方法為氨氮試劑盒、硝酸鹽和亞硝酸鹽試劑盒對菌液進行快速目視半定量鑒定.根據(jù)試劑盒中的指示向裝有菌液的孔中滴加氨氮試劑（Ⅰ）1 滴，震蕩均勻，再滴加氨氮試劑（Ⅱ）1 滴，搖勻放置5 min，自上而下與該試劑盒提供的標準比色卡根據(jù)顏色深淺測定菌液中的氨氮，深黃色用“++”表示，淺黃色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“-”表示.同樣的方法，向孔中加入1 小勺亞硝酸鹽試劑，搖動使其溶解，靜置5 min 后，進行目視比色，深紅色用“++”表示，淺紅色或粉紅色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“－”表示.向孔中加入1 小勺硝酸鹽試劑，振搖1 min，放置15 min 測定出硝態(tài)氮的含量，深紅色用“++”表示，淺紅色或粉紅色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“－”表示.這種方法能同時鑒定幾十株甚至上百株硝化細菌，實現(xiàn)對硝化細菌的高通量、快速篩選.

1.2.5 硝化細菌的保存

向菌株富集管中剩余的菌液中加入等體積的體積分數(shù)為40%的甘油，震蕩均勻，放入－20 ℃冰箱保存.

1.2.6 復篩

將初篩得到的硝化細菌進行復篩，即將篩選到的硝化細菌接到化學需氧量（COD）為167 mg/L、氨氮為86 mg/L 的市政污水中，將其放入搖床，在28 ℃、170 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，再用國標法測定COD 和氨氮的降解率[13-14].

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

通過分離培養(yǎng)基篩選出了94 株單菌，將這些單菌分別接到裝有鑒定培養(yǎng)基的96 孔深孔培養(yǎng)板中，然后用各試劑盒對氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽進行驗證，有41 株菌被初步確定為硝化細菌，它們具體的硝化特性如表1 所示.

表1 41 個菌株的硝化特性Tab.1 Nitrification characteristics of 41 strains

2.2 復篩

將初篩得到的41 株硝化細菌按1.2.6 復篩方法處理，再對其進行功能驗證，得到25 株高效的硝化細菌，其COD 和氨氮降解率如表2 所示.

表2 25 個菌株對污水中COD 和氨氮的降解效率Tab.2 Decomposition efficiency of COD and ammonia nitrogen in sewage of 25 strains

由表2 可知，JZZ-13、JZZ-49、JZZ-64 和JZZ-90 菌株處理污水的效果最好.

3 結(jié)論

本課題組首先通過分離培養(yǎng)基篩選出94 株單菌，再用氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽試劑盒初步篩選出41 株硝化細菌.該方法大大降低了用傳統(tǒng)方法直接篩選單菌的工作量，縮短了菌種篩選的時間.繼而對這些菌進行功能驗證，復篩得到了25 株對污水中的COD 和氨氮降解效果好的硝化細菌.因此，這25 株硝化細菌對污水的處理有很重要的應用價值.同時，課題組還研究了一種利用96 孔板和試劑盒高通量快速篩選硝化細菌的方法，能同時篩選出幾十株甚至上百株硝化細菌，這在很大程度上降低了工作量，提高了工作效率.

[1]李靜，王文文，梁磊，等.耐鹽好氧反硝化菌篩選及其反硝化特性的研究[J].環(huán)境科學與技術，2011，34（6）：48—52.

[2]KENNISH M J.Environmental threats and environmental future of estuaries[J].Environ Conserv，2002，29（7）：78—107.

[3]竇立軍，蔣進元，黃永亨，等.兩株自養(yǎng)型氨氧化細菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].環(huán)境科學研究，2011，24（11）：1312—1313.

[4]李帆，莢榮，查誠.脫氮菌株P6 的分離鑒定及其處理氨氮廢水的試驗研究[J].生物技術，2007，17（5）：64—68.

[5]段慧源，趙樹蘭，多立安.生態(tài)塘組合工藝在天津濱海新區(qū)城市污水處理中的應用策略[J].天津師范大學學報：自然科學版，2010，30（2）：62—66.

[6]汪蘋，王斌，劉軍.同步硝化反硝化處理氨氮廢水過程中氣態(tài)脫氮產(chǎn)物的研究[J].環(huán)境科學研究，2005，18（5）：67—71.

[7]胡君利，林嫌貴，褚海燕，等.土壤氨氧化細菌的分離方法研究[J].土壤，2005，37（5）：569—571.

[8]INNEREBNER G，KNAPP B，VASARA T，et al.Traceability of ammonia-oxidizing bacteria in compost-treated soils [J].Soil Biology&Biochemistry，2006，38（5）：1092—1100.

[9]王成林，周巧紅，王亞芬，等.一株異養(yǎng)硝化細菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（3）：1146—1150.

[10]曾慶武，梁運祥，葛向陽.反硝化細菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2008，27（5）：616—620.

[11]EBRU C，MEHMET A K.Isolation and characterization of aerobic denitrifiers from agricultural soil[J].Turkish Journal of Biology，2004，28（1）：9—14.

[12]黃玨.硝化細菌的分離和鑒定[J].水產(chǎn)科技情報，2004，31（3）：130—131.

[13]國家環(huán)境保護總局科技標準司.HJ/T 399-2007，水質(zhì)化學需氧量的測定快速消解分光光度法[S].北京：中國環(huán)境科學出版社，2007.

[14]國家環(huán)境保護部科技標準司.HJ 535-2009，水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法[S].北京：中國環(huán)境科學出版社，2009.