陳學(xué)彰 田華琴 黃志慶 梁貴文 黃小青 王 斌 楊耀林

佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000

肺積方對Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表達(dá)的實驗研究

陳學(xué)彰 田華琴 黃志慶 梁貴文 黃小青 王 斌 楊耀林

佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000

目的觀察肺積方對Lewis肺癌小鼠腫瘤表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)的影響。方法將48只近交系C57小鼠常規(guī)接種Lewis肺癌細(xì)胞，隨機(jī)分為模型組、順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組，每組12只。治療后處死，取腫瘤組織稱重，計算抑瘤率，并將腫瘤組織固定于10％甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化檢測、圖像定量分析EGFR及TNF-α的表達(dá)。結(jié)果順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組，其對腫瘤均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為30.95％、15.54％、39.79％。與順鉑組比較，EGFR的積分光度由高到低、平均灰度由低到高分別為肺積方組、順鉑組、順鉑+肺積方組(Plt;0.05)。與順鉑組相比，TNF-α的積分光度由低到高、平均灰度由高到低分別為肺積方組、順鉑組、順鉑+肺積方組(Plt;0.05)。結(jié)論肺積方對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的生長具有一定的抑制作用，但低于順鉑組，順鉑與肺積方聯(lián)合使用效果最佳，其機(jī)制可能與降低EGFR的表達(dá)及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

肺積方； Lewis； 肺癌； 表皮生長因子受體； 腫瘤壞死因子-α

原發(fā)性支氣管肺癌簡稱肺癌，是全球常見的惡性腫瘤之一。近數(shù)十年肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高的趨勢，目前已成為我國惡性腫瘤中排名第一位的殺手。中醫(yī)認(rèn)為肺癌是正氣虛損與邪毒長期共同作用的結(jié)果，以氣虛、陰虛尤為明顯[1]。有臨床研究[2-3]表明：肺癌病例的證候分布，以正虛為主者超過97％，且以陰虛和氣陰兩虛兩種類型為多，占總數(shù)的80％以上。肺積方是本院腫瘤內(nèi)科使用益氣養(yǎng)陰法治療肺癌的經(jīng)驗方，臨床療效顯著。本實驗通過觀察肺積方對Lewis肺癌小鼠腫瘤表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)的影響，探討肺積方抗腫瘤的分子作用機(jī)制，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株

近交系C57小鼠51只，其中3只用作傳代，體重為(18.0±2.0)g，購自廣州醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(合格證號：0043452)。Lewis肺癌小鼠細(xì)胞購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物

肺積方：浙貝、天冬、沙參、石上柏、八月扎、薏苡仁、魚腥草。用文火煎汁濃縮，采用人動物劑量換算公式換算為小鼠用量，0.4 ml合生藥60 g的劑量，置于4 ℃冰箱備用。順鉑：10 mg/支。

1.3 試劑及儀器

EGFR免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(上海晶科生物有限公司，批號：20110130)，TNF-α的免疫組化DAB顯色試劑盒(上海晶科生物有限公司，批號：20110130)，鼠抗人EGFR抗體(福州邁新生物技術(shù)有限公司，批號：20110217)。生物顯微鏡、恒溫水浴箱等。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 液氮凍存的Lewis肺癌小鼠細(xì)胞復(fù)蘇后，先接種在3只C57小鼠右腋窩下傳代。10 d后，脫頸處死荷瘤小鼠，分離瘤體，取生長良好的腫瘤組織，加生理鹽水，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整瘤細(xì)胞密度為每毫升生理鹽水中含1×10個瘤細(xì)胞。選C57小鼠48只，于每只小鼠右腋窩皮下注射腫瘤懸液0.2 ml。隨機(jī)分為4組，每組12只小鼠，分別為模型組、順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組。

1.4.2 給藥 模型組：接種24 h后開始予生理鹽水0.4 ml/只灌胃，1次/d，共14 d，從接種第6天開始腹腔注射生理鹽水0.2 ml/只，1次/d，連續(xù)5 d。順鉑組：從接種后第6天開始腹腔注射順鉑，按每公斤體重1 mg的劑量(相當(dāng)于1/10 LD50)給藥，1次/d，余同模型組。肺積方組：接種24 h后開始予肺積方0.4 ml/只灌胃，1次/d，共14 d；從接種第6天開始腹腔注射生理鹽水0.2 ml/只，1次/d，連續(xù)5 d。順鉑+肺積方組：同順鉑組+肺積方組處理。

1.4.3 標(biāo)本采集 灌胃14 d后，動物禁食不禁水24 h，將小鼠脫頸處死，即刻解剖小鼠進(jìn)行局部腫瘤取材，把腫瘤組織稱重，并固定于10％的甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 抑瘤率 常規(guī)統(tǒng)計各組小鼠的抑瘤率(％)。

1.5.2 瘤塊EGFR表達(dá)的測定 采用免疫酶標(biāo)技術(shù)(SABC法)作免疫組化染色。免疫組化法將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，封閉內(nèi)源性過氧化酶活性。4 ℃條件下將標(biāo)本與1∶100稀釋的CB一抗孵育過夜的PBS洗滌3次后，再與生物素標(biāo)記的二抗作用，PBS洗滌3次后加入結(jié)合有辣根過氧化酶的生物素-卵白素復(fù)合物，最后加入底物DAB染色，凡細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性染色細(xì)胞。對實驗結(jié)果采用計算機(jī)圖像分析：于400倍高倍視野下，隨機(jī)選取各組10個視域，測取棕黃色反應(yīng)物場，觀察積分光度、平均灰度。其中積分光度值越高免疫組化的陽性表達(dá)強(qiáng)度越高；而平均灰度值越高其陽性表達(dá)強(qiáng)度越低。

1.5.3 TNF-α表達(dá)的測定 組織石蠟切片采用免疫組化法作測定。依次進(jìn)行石蠟切片，脫水，5％～10％山羊血清封閉，4 ℃條件下將標(biāo)本與CB一抗孵育過夜的PBS洗滌3次后，再與生物素標(biāo)記的二抗作用，PBS洗滌3次后加入結(jié)合有辣根過氧化酶的生物素-卵白素復(fù)合物，最后加入底物DAB染色，然后對實驗結(jié)果采用計算機(jī)圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采集免疫組織化學(xué)染色圖像，用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)研制的MPIAS-500多媒體病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用q檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織生長的影響

與模型組比較，順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組對小鼠腫瘤組織生長均有抑制作用(Plt;0.05)。與順鉑組比較，肺積方組對腫瘤組織的抑制作用較弱(Plt;0.05)，順鉑+肺積方組與順鉑組比較無明顯差異。見表1。

2.2 對Lewis肺癌小鼠EGFR表達(dá)的影響

順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明三組對腫瘤組織中EGFR的表達(dá)均有抑制作用。與順鉑組比較，肺積方組對腫瘤組織中EGFR的表達(dá)的抑制作用較弱(Plt;0.05)，而順鉑+肺積方組較強(qiáng)(Plt;0.05)。見表2。

表1 對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織生長的影響(n=12)

與模型組比較▲Plt;0.05；與順鉑組比較△Plt;0.05

表2 對Lewis肺癌小鼠EGFR表達(dá)的影響(n=12)

與模型組比較▲Plt;0.05；與順鉑組比較△Plt;0.05

2.3 對Lewis肺癌小鼠TNF-α表達(dá)的影響

順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明三組對腫瘤組織中TNF-α的表達(dá)均有抑制作用。與順鉑組比較，肺積方組對腫瘤組織中TNF-α的表達(dá)抑制作用較弱(Plt;0.05)，而順鉑+肺積方組較強(qiáng)(Plt;0.05)。見表3。

表3 對Lewis肺癌小鼠TNF-α表達(dá)的影響(n=12)

與模型組比較▲Plt;0.05；與順鉑組比較△Plt;0.05

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺為“嬌臟”，位居華蓋，喜潤惡燥，易受內(nèi)外邪氣的侵襲，一旦邪毒蘊(yùn)肺，極易耗傷肺氣，灼傷肺陰。氣陰虧虛常常貫穿肺癌發(fā)病始終，而益氣養(yǎng)陰之法是中醫(yī)藥治療肺癌之本，也是目前的主要治療大法[4]。本院肺積方是治療肺癌的經(jīng)驗方，以益氣養(yǎng)陰為主，方中北沙參性味甘、微苦，微寒。歸肺、胃經(jīng)。輕揚(yáng)上浮，具有補(bǔ)肺陰，清肺火之功。南沙參性味甘、微寒。歸肺、胃經(jīng)。功效養(yǎng)陰清肺、補(bǔ)氣化痰。南北沙參相配，潤肺止咳，滋陰祛痰。天冬性寒，味甘、苦。上能入肺，下能補(bǔ)腎，滋陰潤燥之力更強(qiáng)。三藥聯(lián)合，補(bǔ)氣而不補(bǔ)火，滋陰而不滋膩，共奏益氣養(yǎng)陰之功。浙貝味大苦，性寒，功能清熱化痰，散結(jié)解毒。八月扎性微寒，味苦，能瀉火行水、通血脈。石上柏味甘，性平，能清熱解毒、活血化瘀。兩藥配伍，共奏活血祛瘀、清化癌瘤之效。生苡仁性味甘淡微寒，既去生痰之源又無傷陰之弊。魚腥草辛,微寒，歸肺經(jīng)，能清熱解毒、消癰排膿。全方培土生金、金水相生共冶一爐，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)、清熱散結(jié)之功。

EGFR是一種細(xì)胞膜受體，能與EGF及TGF-α等有效結(jié)合，引起細(xì)胞增殖。在病理狀態(tài)下，EGFR可能存在自身激活從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。EGFR在肺癌中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管生成、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞的凋亡等密切相關(guān)[5]。Piyathilake等[6]用免疫組化法檢測了60例肺鱗癌患者的腫瘤組織和正常肺組織標(biāo)本中EGFR和erbB22的表達(dá)，結(jié)果肺鱗癌組織中EGFR 和erbB22的表達(dá)明顯高于正常肺組織，而且EGFR在正常肺組織、癌前病變和肺癌組織中的表達(dá)是逐級升高的。

TNF-α是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要來源于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它是參與機(jī)體免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，具有抗腫瘤、抗感染等作用，可作為腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物及鑒定腫瘤預(yù)后的一項指標(biāo)，參與多種生理與病理過程[7]。TNF-α主要通過以下三方面機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[8]：①對敏感的腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用或抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用；②多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生、釋放、并激活宿主的抗腫瘤機(jī)制，通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用;③對腫瘤血管結(jié)構(gòu)的影響發(fā)揮抗腫瘤作用。其最大特點是能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而不影響正常細(xì)胞的生長、分泌和代謝功能。

對于TNF-α的表達(dá)，本研究證明：順鉑組、肺積方組、順鉑+肺積方組與模型組比較，積分光度與平均光度均升高，平均灰度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。與順鉑組相比，積分光度由低到高、平均灰度由高到低分別為肺積方組、順鉑組、順鉑+肺積方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。說明肺積方能促進(jìn)TNF-α分泌，抑制Lewis肺癌腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，但效果不及順鉑組，肺積方聯(lián)合順鉑效果更佳。

而關(guān)于EGFR的表達(dá)，實驗證明：肺積方、順鉑、順鉑+肺積方對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的生長均有抑制作用且均能降低EGFR的表達(dá)，但肺積方組的抑制作用及降低EGFR表達(dá)的作用不如順鉑組及順鉑+肺積方組?？紤]其原因有以下兩點：①給藥途徑不同。肺積方為口服，順鉑為腹腔注射，前者無論是吸收速度抑或利用率都低于后者。②作用機(jī)制不同。肺積方為中藥湯劑，其作用為全身多靶點的，其具體作用機(jī)制及最佳劑量、療程不清，本實驗只能依照經(jīng)驗制訂藥物使用劑量及療程；順鉑為主要作用在DNA的嘌呤和嘧啶堿基的重金屬絡(luò)合物，經(jīng)過眾多實驗研究及臨床應(yīng)用，其最佳劑量及療程相對明確，且被本實驗嚴(yán)格執(zhí)行。因此本實驗觀察到肺積方抑瘤及降低EGFR表達(dá)的作用相較于順鉑及順鉑+肺積方不理想，可能與其尚未達(dá)到需要的血藥濃度、藥物持續(xù)作用時間不足有關(guān)。適當(dāng)延長療程或制成注射液靜脈給藥，肺積方的作用結(jié)果可能會更理想，尚有待于進(jìn)一步實驗研究。

另外，在對EGFR表達(dá)的檢測中，本實驗應(yīng)用計算機(jī)進(jìn)行圖像分析，大大提高了信息的精度，使實驗具有更高的精密度和客觀性[9]。各實驗組對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中EGFR表達(dá)圖像分析結(jié)果與其對瘤體重量影響的結(jié)果具有高度一致性，可見抑瘤的作用機(jī)制與降低EGFR的表達(dá)密切相關(guān)，但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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ExperimentalStudyofFeijiRecipeonAntitumorRate，ExpressionofEGFRandTNF-αinMicewithLewisLungCancer

CHEN Xuezhang，TIAN Huaqin，HUANG Zhiqing，et al

FoshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Guangdong，F(xiàn)oshan528000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Feiji recipe on tumor weight，epidermal growth factor receptor(EGFR)and tumor necrosis factor-α (TNF-α) expressions in mice bearing Lewis lung cancer.Methods48 inbred c57 mice were inoculated with Lewis lung cancer cells，then divided into model group，cisplatin group，F(xiàn)eiji recipe group，and cisplatin+ Feiji recipe group.Each group contains 12 mice.After 14 days’ treatment the mice were sentenced to death.Weigh the tumor tissues，calculate antitumor rates，then fix the tissue with 10％ formaldehyde solution，routinely make paraffin-embedded sections，and use immunohistochemistry to detect the expression of EGFR and TNF-α.ResultsCisplatin，F(xiàn)eiji recipe and cisplatin+ Feiji recipe all have inhibitory effects on Lewis lung cancer (Plt;0.05)，and all can decrease the expression of EGFR(Plt;0.05) while increase the expression of TNF-α.Compared with cisplatin group，the effect of cisplatin+ Feiji recipe group and Feiji recipe group is not good.ConclusionFeiji recipe can inhibit the growth of Lewis lung cancer tumor，but the effect is not better than cisplatin group.The inhibiting effect is more significant by cisplatin combining with Feiji recipe.Its mechanism has correlation with decreasing the expression of EGFR and increasing the expression of TNF-.

Feiji recipe；Lewis；lung cancer；EGFR;TNF-α

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.005

2013-01-06)