甲型流感病毒兩種快速檢測(cè)方法的診斷效能評(píng)價(jià)

余虹宇，王順濤，劉 彬，李筱芳

流感病毒的檢測(cè)方法通常包括病毒分離培養(yǎng)法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR 技術(shù))、基因芯片技術(shù)等［1-3］。病毒分離培養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)，且設(shè)備昂貴、操作繁瑣，不便于大規(guī)模應(yīng)用;PCR 技術(shù)也需要昂貴的儀器設(shè)備和受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員。神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是流感病毒包膜的重要組成成分，在病毒的感染、復(fù)制和致病過(guò)程中起著重要作用，NA 抑制藥可以通過(guò)抑制NA 活性而有效地控制流感癥狀和疾病的傳播［4，5］。因此，近年來(lái)NA 活性檢測(cè)已成為流感病毒檢測(cè)、抗流感病毒藥物篩選和活性評(píng)價(jià)的重要有效指標(biāo)［6］。本研究以甲型流感病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為參照，對(duì)目前國(guó)外廣泛應(yīng)用的兩種流感病毒神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑的臨床診斷效能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為甲型流感病毒流行的早期臨床診斷和預(yù)防控制提供可靠的方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012-02至2012-05 深圳市某醫(yī)院因不明原因發(fā)熱、伴有呼吸道癥狀的發(fā)熱門(mén)診或住院患者377例，其中男203例，女174例，年齡4～68歲，包括急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、肺炎、發(fā)熱待查等。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 神經(jīng)氨酸酶凍干品購(gòu)自Sigma 公司;化學(xué)顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-4，7-二甲氧基-N-乙酰神經(jīng)氨酸(X-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac)為本實(shí)驗(yàn)室自行合成;熒光底物4-甲基傘形酮-4，7-二甲氧基-N-乙酰神經(jīng)氨酸(4-MU-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac)購(gòu)自深圳市艾瑞生物科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。病毒采樣保存液為廣州市宜康生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120108。甲型/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒為江蘇碩世生物科技有限公司產(chǎn)品(國(guó)藥食監(jiān)械(準(zhǔn))字2012 第3401296號(hào))，批號(hào)20120101。RF2510 型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品。ABI 7500 FAST 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2.2 標(biāo)本采集 取3 支咽拭子適度用力拭抹鼻腔分泌物最多的部位，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)鼻咽拭子，并向鼻腔根部推進(jìn)，直至鼻甲部位，在鼻腔內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)2～3 圈拭子后取出，放入病毒采樣保存液中，保存于-70℃，集中檢測(cè)，標(biāo)本避免反復(fù)凍融。使用前應(yīng)將標(biāo)本平衡至室溫。保存液中含有牛血清白蛋白和海藻糖等神經(jīng)氨酸酶保護(hù)劑，對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響，拭子無(wú)需進(jìn)行處理，化學(xué)顯色法和熒光檢測(cè)法可直接使用。流感病毒核酸檢測(cè)則需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理。

1.2.3 化學(xué)顯色法檢測(cè) 將采集好的鼻咽部拭子插入0.5 ml 反應(yīng)液(25 mM pH6.5 MES，4 mM CaCl2，200 μM X-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac)中，緊靠管壁旋轉(zhuǎn)拭子多圈使標(biāo)本盡可能洗脫在反應(yīng)液中，棄去拭子。將反應(yīng)管至于37℃恒溫箱溫育1 h，溫育結(jié)束后加入50 μl 2 M 的硫酸終止反應(yīng)，直接觀察顏色判讀結(jié)果，顯示藍(lán)色為陽(yáng)性，不顯色者為陰性。

1.2.4 熒光法檢測(cè) 將采集好的鼻咽部拭子插入0.5 ml 反應(yīng)液(50 mM pH6.5 MES，4 mM CaCl2，100 μM 4-MU-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac)中，緊靠管壁旋轉(zhuǎn)拭子多圈使標(biāo)本盡可能洗脫在反應(yīng)液中，棄去拭子。將反應(yīng)管至于37℃恒溫箱溫育30 min，溫育結(jié)束后加入100 μl 新配制的終止液(0.1 M 甘氨酸，0.14 M NaOH，83%乙醇)終止反應(yīng)。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。以PCR 檢測(cè)流感病毒陰性標(biāo)本為陰性對(duì)照，若標(biāo)本熒光強(qiáng)度/陰性對(duì)照比值≥2.1 判定為陽(yáng)性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行檢測(cè)。操作步驟簡(jiǎn)述如下:(1)樣品處理:充分混勻上述標(biāo)本，取100 μl 液體標(biāo)本加入500 μl RNA 提取液A 充分震蕩，室溫放置5 min。加入100 μl 氯仿，用力震蕩15 s，室溫靜置5 min，4℃13 000 r/min 離心5 min。小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300 μl 無(wú)水乙醇，另加10 μl RNA 提取液B，充分混勻，13 000 r/min 離心1 min。棄上清，加入500 μl 75%的DEPC 乙醇，充分混勻，13 000 r/min離心1 min，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口在室溫空氣中干燥5 min，待乙醇揮發(fā)干凈，用20 μl DEPC H2O 溶解沉淀。陰性質(zhì)控品:取100 μl陰性質(zhì)控品加入500 μl RNA 提取液A 充分震蕩，室溫放置5 min。后按前述加氯仿等步驟操作。陽(yáng)性質(zhì)控品:直接取3 μl 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。(2)PCR 擴(kuò)增:按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，循環(huán)條件:42℃→20 min，后94℃→2 min，后93℃30 s→55℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。(3)反應(yīng)結(jié)束后，使用手動(dòng)調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40 以上，Ct值小于38個(gè)循環(huán)的為陽(yáng)性;Ct值在38～40個(gè)循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后，如果Ct值仍然在38～40個(gè)循環(huán)之間，判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有熒光值增長(zhǎng)為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0 上，用McNemar 檢驗(yàn)(優(yōu)勢(shì)性χ2檢驗(yàn))比較兩種方法檢測(cè)甲型流感病毒樣本的檢測(cè)效能，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法的診斷效能分析 以PCR 檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)顯色法陽(yáng)性病例檢測(cè)相對(duì)靈敏度為79.08% (121/153)，陰性病例相對(duì)特異性為91.96% (206/224)，與 PCR 法的總符合率為86.74%，陽(yáng)性預(yù)期值為87.05%(121/139)，陰性預(yù)期值為86.55%(206/238);而熒光法檢出甲型流感病毒陽(yáng)性相對(duì)靈敏度為90.20%(138/153)，陰性相對(duì)特異性為95.09%(213/224)，與PCR 法的總符合率為93.10%，陽(yáng)性預(yù)期值為92.62%(138/149)，陰性預(yù)期值為93.42%(213/228)(表1)。

2.2 兩種方法的符合率分析 化學(xué)顯色法和熒光法檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本有80例，其中化學(xué)顯色法陽(yáng)性而熒光法陰性的標(biāo)本35例，PCR 證實(shí)為陽(yáng)性有17例;化學(xué)顯色法陰性而熒光法陽(yáng)性標(biāo)本45例，PCR 證實(shí)為陽(yáng)性有34例?；瘜W(xué)顯色法和熒光法對(duì)甲型流感病毒的檢出率相仿，其差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.25，P＞0.05)，兩種方法的總符合率為78.78%(表2)。

表1 化學(xué)顯色法、熒光法與熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)結(jié)果

表2 化學(xué)顯色法與熒光法兩種檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

近年來(lái)，流感病毒仍然呈現(xiàn)周期性全球流行趨勢(shì)，尤其是從2009年開(kāi)始，甲型H1N1 流感病毒在全球范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)流行，對(duì)廣大易感人群具有很大的危害性?？焖?、準(zhǔn)確、適用的流感病毒篩查技術(shù)對(duì)于及時(shí)有效的預(yù)防和控制流感疫情起著十分關(guān)鍵的作用。與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)法相比，流感病毒的快速檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，因此常用于流感暴發(fā)時(shí)早期病原學(xué)檢測(cè)。流感的快速檢測(cè)包括直接和間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、流感抗原快速檢測(cè)試劑盒等［1-3，7-9］。這些方法中除抗原快速檢測(cè)法外，其余均需特殊的技術(shù)和設(shè)備，操作耗時(shí)、成本高。在甲型流感病毒的預(yù)防控制中，盡快篩選出病毒感染者，及早進(jìn)行隔離治療，才能從根本上遏制病毒的流行。病毒相關(guān)抗原和酶活性的檢測(cè)與病毒培養(yǎng)及病毒核酸檢測(cè)等方法相比，具有耗時(shí)短、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)器材，實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所要求也不高，而且有利于迅速分流患者，及時(shí)隔離疑似患者，盡早實(shí)施對(duì)癥治療。

流感病毒抗原和神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)，是目前流感病毒實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)技術(shù)，適合于現(xiàn)場(chǎng)篩查和檢測(cè)。用顯色基團(tuán)或熒光基團(tuán)修飾4，7-二甲氧基-N-乙酰神經(jīng)氨酸，對(duì)檢測(cè)流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性，較用顯色基團(tuán)或熒光基團(tuán)修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸(X-NANA 或者4-MUNANA)，具有顯著的專一性［10］，消除了副流感病毒及腮腺炎病毒產(chǎn)生的假陽(yáng)性反應(yīng)［10］。顯色法檢測(cè)原理為底物X-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac 在神經(jīng)氨酸酶作用下分解，游離的顯色基團(tuán)X(即5-溴-4-氯-3-吲哚基)在空氣氧化生成靛藍(lán)而呈藍(lán)色，若標(biāo)本中不存在或者神經(jīng)氨酸酶活性很低則不顯色。該反應(yīng)中顯色基團(tuán)X 生成靛藍(lán)的過(guò)程比較緩慢，至少需要1 h 才能完成。在熒光法檢測(cè)中，以熒光基團(tuán)4-MU(即4-甲基傘形酮)取代顯色基X，熒光底物4-MU-4，7-di-O-Me-Neu-5-Ac 在神經(jīng)氨酸酶作用下分解，游離的熒光物質(zhì)4-MU 即可在激發(fā)光下實(shí)時(shí)發(fā)出熒光，這一反應(yīng)過(guò)程快速，30 min 即可完成檢測(cè)。在本研究中，采用的均是此類化學(xué)顯色和熒光底物，而沒(méi)有采用報(bào)道的4-MUNANA 底物［11，12］，其目的在于提高檢測(cè)結(jié)果的特異性。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化學(xué)顯色法和熒光法對(duì)甲型流感病毒的檢出率相仿，其差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.25，P＞0.05)，兩種方法的總符合率為78.78%，特異性均達(dá)到90%以上，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道相一致。此外，與PCR 方法相比，這兩種病毒快速檢測(cè)方法均不需特殊的場(chǎng)所和昂貴儀器設(shè)備，具有價(jià)格低廉、易操作、檢測(cè)周期短、結(jié)果判讀簡(jiǎn)便可行等優(yōu)點(diǎn)。在臨床實(shí)際應(yīng)用中，采用化學(xué)顯色法進(jìn)行甲型流感病毒檢測(cè)操作更為簡(jiǎn)便，處理大量樣本更為方便，尤其適用于機(jī)場(chǎng)、海關(guān)等人流量大的場(chǎng)所。而甲型流感病毒熒光檢測(cè)法靈敏度則更高，更適用于醫(yī)院甲型流感病毒感染快速診斷，特別適宜于在尚不具備病毒核酸檢測(cè)能力的基層醫(yī)院開(kāi)展。

［1］李增德，張偉龍，許凌峰，等.新甲型H1N1 流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.武警醫(yī)學(xué)，2010，21(3):262-264.

［2］Hui Donga，Zhang Yanjun，Hui Xiong，et al.Detection of human novel influenza A (H1N1)viruses using multi-fluorescent real time RT-PCR［J］.Virus Research，2010，147(1):85-90.

［3］孫珊珊，沈國(guó)順，田明堯，等.甲型H1N1 與季節(jié)性H1N1 流感病毒檢測(cè)基因芯片的制備與初步應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30(5):634-638.

［4］Colman P M.Influenza virus neuraminidase:structure，antibodies and inhibitors ［J］.Protein Sci，1994，3:1687-1696.

［5］Cao H P，Tao P Z，Du G H.Establishment and applicationof high throughput screening model for influenza virusneuraminidase inhibitors in vitro［J］.Acta Pharm Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，2002，37:930-933.

［6］Peng Y，Li W K.Recent development of studies on antivirus phytomedicines in abroad ［J］.World Phytomed(國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè))，1999，14:7.

［7］賈 寧，閆中強(qiáng).免疫滲濾與膠體金快速檢測(cè)在篩查甲型流感中的診斷效率分析［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(10):2267-2269.

［8］張 然，程小雯等.熒光定量RT-PCR 快速檢測(cè)A型流感病毒的研究［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6(1):33-35.

［9］李月越，陳杭薇等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)流感病毒應(yīng)用研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(18):1652-1654.

［10］C D Shimasaki，K E Achyuthan.Rapid diagnostics:the detection of neuraminidase activity as a technology for high-specificity targets［J］.Phil Trans R Soc Lond B，2001，356:1925-1931.

［11］劉艾林，杜冠華.流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選［J］.中國(guó)科學(xué)(C 輯)，2005，35(1):2-5.

［12］李寒冰，鄢 丹.基于神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)的板藍(lán)根品質(zhì)的生物評(píng)價(jià)［J］.藥物學(xué)報(bào)，2009，44(2):162-166.