邢曉波，黃 訓(xùn)，朱德斌，王海燕，蔡繼業(yè)

(1.暨南大學(xué)化學(xué)系，廣東廣州 510632;2.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所教育部重點實驗室，廣東廣州 510631;3.暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632;4.廣州計量檢測技術(shù)研究院，廣東 廣州 510663)

T淋巴細(xì)胞是在胸腺中分化成熟的淋巴細(xì)胞，故稱胸腺依賴性淋巴細(xì)胞(Thymus-dependent lymphocyte)，簡稱T細(xì)胞。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多，功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞，是承擔(dān)細(xì)胞免疫的活性細(xì)胞。T細(xì)胞具有抗原識別受體，因此它們必需經(jīng)抗原刺激才能活化而發(fā)揮其效應(yīng)細(xì)胞的作用，為特異性細(xì)胞免疫。大量的研究表明［1］，病原體感染、腫瘤的發(fā)生、自身免疫性疾病的發(fā)生以及有關(guān)組織器官移植排斥等都與T細(xì)胞抗原識別和活化異?；蚱x相關(guān)?？乖且活惸艽碳C體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，發(fā)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)，是引起特異性免疫的激發(fā)原［2］。當(dāng)T淋巴細(xì)胞識別出細(xì)胞表面存在抗原多肽時，免疫系統(tǒng)便將其認(rèn)為異種細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞，病毒感染的細(xì)胞)并開始攻擊。因此，T細(xì)胞的抗原識別和活化可以直接影響整個免疫應(yīng)答的性質(zhì)、效能和結(jié)果，在人體免疫反應(yīng)中具有核心作用。T淋巴細(xì)胞活化主要表現(xiàn)為細(xì)胞分裂增殖，克隆擴增，并出現(xiàn)分化，由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞并執(zhí)行各種功能［3］。而T淋巴細(xì)胞的靜息和(不同時間的)活化期，表達(dá)在細(xì)胞膜的膜表面抗原分子的種類和數(shù)量也是不同的，同時，T淋巴細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性會發(fā)生一系列的變化［4-5］。由于細(xì)胞膜表面受體和表達(dá)蛋白等都是生物大分子，特征尺寸在10～100 nm量級，細(xì)胞力學(xué)特性的變化在皮牛頓量級，這就需要有高分辨率的納米手段和高靈敏度的測力手段對其進行研究。隨著生物納米技術(shù)的發(fā)展和掃描探針顯微術(shù)的發(fā)展，使得原子力顯微鏡(AFM)能夠分析細(xì)胞和生物材料的納米結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性［6-8］。

機體的器官、組織、細(xì)胞和生物大分子在一定范圍力學(xué)作用下發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)和功能改變，這是機體對力學(xué)刺激的響應(yīng)過程，而機體對一定范圍力學(xué)刺激的自適應(yīng)對于維持正常生理功能具有重要作用。研究力對細(xì)胞的作用，是揭示器官、組織生物力學(xué)特性的基礎(chǔ)，也是進一步研究細(xì)胞內(nèi)生物大分子的生物力學(xué)特性的出發(fā)點。細(xì)胞粘附包括細(xì)胞之間的粘附以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附，其中細(xì)胞之間粘附是細(xì)胞間信息交流的一種形式，細(xì)胞與基質(zhì)的粘附與細(xì)胞的遷移和運動密切相關(guān)［9］，其過程涉及復(fù)雜的細(xì)胞生物化學(xué)、機械性能、表面鍵合、電荷、自由能、疏水性等因素［10］，細(xì)胞的彈性是細(xì)胞維持其形態(tài)和承受一定的壓力所必須的，因此對研究T細(xì)胞活化前后粘附力和彈性模量的變化，對于揭示其生物學(xué)功能具有重要的意義。大量研究表明，力可以通過影響細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在細(xì)胞的生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用［11］。

本實驗基于AFM的力譜測量功能，對靜止(resting)T淋巴細(xì)胞以及經(jīng)超抗原(SEA)或植物凝集素(PHA)活化后T淋巴細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面超微結(jié)構(gòu)成像和探測研究，并通過比較不同狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞表面粘附力和硬度的變化，探討T淋巴細(xì)胞形態(tài)變化與粘附行為和細(xì)胞硬度之間的關(guān)系，以便能更深入地了解T淋巴細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞行為之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要儀器

健康人外周血，收集于肝素鈉抗凝的試管內(nèi);超抗原(StaphylococcalenterotoxinA，SEA)、植物凝集素(Phytohaemagglutinin，PHA)、戊二醛均購自 Sigma公司;人外周血淋巴細(xì)胞分離液，人T細(xì)胞富集液(RosetteSep?HumanT Cell Enrichment Cocktail)均購自AXIS SHIELD PoC AS公司;RPMI-1640、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及β-巰基乙醇等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均為GibcoBR公司產(chǎn)品;其它試劑均采用國產(chǎn)分析純，實驗用水為超純水。原子力顯微鏡 (Autoprobe CP research，thermomicroscopes公司，美國)。

1.2 T細(xì)胞的分離和活化

將2mL健康人外周血與肝素抗凝劑混勻以抗凝。具體分離步驟如下:1)將100μL T細(xì)胞富集液與2mL全血輕輕混勻，并在室溫下孵育20 min;2)再用等體積(2mL)的含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS液輕輕稀釋混勻;3)將稀釋后的血輕輕鋪在3mL的密度分離液(Ficoll)上面(注意讓其分層，而不能混合)，然后室溫下以1200 g的速度離心20 min;4)取密度分離液與血漿之間的細(xì)胞富集層(白色)，細(xì)胞用2%BSA+PBS溶液離心洗兩次(425 g，10 min)。將分離的細(xì)胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng) 液 培 養(yǎng)(含 10%FBS 及 50μmol/L β-巰 基 乙醇)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106cells/mL。臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力，活細(xì)胞數(shù)占98%。T淋巴細(xì)胞設(shè)置3組:Resting組(不添加任何外源刺激劑)、SEA(10μg/mL)刺激組和 PHA(10μg/mL)刺激組。將細(xì)胞在24孔板接種后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 樣品的制備

分別取Resting、SEA活化和PHA活化48 h的T淋巴細(xì)胞，滴于干凈的蓋玻片上，使其自然鋪展，吸附10 min，然后用1.5%的戊二醛固定10～15 min，用蒸餾水沖洗3次，室溫自然干燥。

1.4 AFM成像及力譜測量

將制備好的樣品置于AFM的XY掃描臺上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，在空氣中室溫下，利用接觸模式成像。實驗采用100μm掃描器，UL20B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m。AFM圖像僅經(jīng)過自帶軟件(IP 2.1版)的平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 13.0進行力曲線相關(guān)數(shù)據(jù)以及細(xì)胞的各項物理參數(shù)統(tǒng)計分析，采用 t檢驗方法，P＜0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義的。取自10個細(xì)胞的所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

2 結(jié)果

2.1 倒置熒光顯微鏡觀察活化前后T細(xì)胞的形態(tài)

圖1a和1b為未加刺激劑培養(yǎng)了48 h時T細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下的形態(tài)，細(xì)胞呈規(guī)則的圓形，從40倍放大成像可以看出細(xì)胞與細(xì)胞之間沒有連接到一起(圖1b)。從圖1c和1d可以看出經(jīng)PHA刺激48 h時，細(xì)胞發(fā)生凝集，出現(xiàn)細(xì)胞團如圖1c中紅色虛線所示，細(xì)胞團大小不一如圖1d中紅色虛線所示。從圖1e和1f也可以看到SEA活化后細(xì)胞也發(fā)生凝集但是與PHA活化相比形成的細(xì)胞團較小，與對照組相比細(xì)胞分布不均勻，有的地方細(xì)胞密度較大有的地方細(xì)胞密度較小。從40倍的放大圖(圖1f)可以看到有些細(xì)胞與細(xì)胞連接到一起。

2.2 T細(xì)胞形貌和膜納米結(jié)構(gòu)的AFM表征

首先，研究了靜息的 T細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)與膜超微結(jié)構(gòu)(如圖2)。從圖2a可以看出靜息的T細(xì)胞為規(guī)則的圓形。其中圖2b是圖2a的三維圖像，圖2c為誤差信號模式圖，在這種成像模式下許多特化結(jié)構(gòu)如細(xì)胞邊緣的偽足等可以更加清楚的顯示出來。從其剖面圖(圖2d)可以看出靜息的T細(xì)胞高度為1.86μm，半高寬為 5.0μm。圖 2e 和圖 2f是膜表面納米結(jié)構(gòu)圖像，其中圖2f是圖2e的三維圖。靜息的T細(xì)胞表面相對比較光滑(圖2e和2f)。為了在納米空間對靜息的和不同活化劑活化的T細(xì)胞的細(xì)胞膜化學(xué)成分的變化進行分析，我們利用AFM的橫向力顯微(Lateral force microscopy，LFM)功能，對細(xì)胞膜表面的變化進行了成像。根據(jù)材料表面物理特性如表面摩擦力的差異，AFM在橫向力成像模式(lateral force，LF)下可以獲得材料表面具有不同物理特性的結(jié)構(gòu)分布［9］。圖2g為靜息的T細(xì)胞膜納米結(jié)構(gòu)的LFM圖，圖中顏色由紅到藍(lán)表示摩擦力由大變小，從圖中可以看出細(xì)胞表面摩擦力的大小分布并不是非常均勻的，這主要是由于細(xì)胞表面顆粒的高度和細(xì)胞膜成分的差異引起的。圖2h是膜表面顆粒粒徑的分布圖，其表面顆粒粒徑分布在20～60 nm之間，其中主要集中在40 nm。

圖1 倒置熒光顯微鏡下T細(xì)胞活化前后的形態(tài)。圖(a)和圖(b)是沒有加刺激劑的T細(xì)胞，圖(c)和圖(d)是T細(xì)胞經(jīng)PHA刺激48 h時的形態(tài)，圖(e)和圖(f)是T細(xì)胞經(jīng)SEA刺激48 h時的形態(tài)Fig.1 Microscopic images of T cells before and after SEA and PHA treatment for 48 h.Concentrations of PHA and SEA used in this study were all 10μg/mL.(a，b，c，d，e and f)images of T cells before(a，b)and after PHA(c，d)and SEA(e，f)treatment

圖2 靜息的T細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)與膜納米結(jié)構(gòu)。圖b是圖a的三維圖像，圖c為誤差信號模式圖，圖d是細(xì)胞a的剖面圖，圖e和圖f是膜表面超微結(jié)構(gòu)圖像，圖g是橫向力(LFM)模式圖，圖k是膜表面顆粒粒徑的分布圖Fig.2 Representative AFM morphological images of resting T cells.(b)3-D image of(a).(c)The signal error mode image.(d)Height profile generated along the black line in(a).(e，f)Ultrastructural images of cell membrane.(g)Lateral force images of(e).(h)The diameter of particles distribution of membrane surface particle in(e)

圖3 經(jīng)刺激劑處理后的活化的T細(xì)胞的具有代表性的形貌圖和膜納米結(jié)構(gòu)圖像。圖a-h顯示了PHA活化的T細(xì)胞的形貌和膜納米結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，圖i-p顯示了SEA活化的T細(xì)胞的形貌和膜納米結(jié)構(gòu)Fig.3 Representative AFM images of activated T cells.(a-h)and(i-p)show the morphology and nanostructure of T cells which are activated by PHA and SEA，respectively

如圖3所示是用PHA和SEA分別刺激活化后的T細(xì)胞的AFM觀察結(jié)果。圖3a到3c是PHA活化后T細(xì)胞的形貌圖，從三維圖(圖3b)和誤差信號圖(圖3c)可以明顯的看到活化后細(xì)胞周圍的蹼狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變的復(fù)雜，黑色箭頭所指示的是T細(xì)胞活化后伸出的類似偽足的結(jié)構(gòu)。從其剖面圖可以得出PHA活化后細(xì)胞高度為2.47μm，半高寬為5.47μm(圖3d)。從AFM高分辨的圖像可以看出，PHA活化的T細(xì)胞表面有豐富的顆粒狀團簇結(jié)構(gòu)如圖3e和3f，團簇大小分布在100～500 nm。從 LFM模式圖(圖3g)可以看出，與靜息細(xì)胞(圖2g)相比，經(jīng)PHA活化后細(xì)胞膜表面的摩擦力的分布變的不均勻，這與PHA活化后膜納米結(jié)構(gòu)的變化相吻合，活化后細(xì)胞膜變的不均一。從AFM的定量數(shù)據(jù)可以得到PHA活化后T細(xì)胞膜表面顆粒大小在40～110 nm，呈正態(tài)分布，主要集中在80 nm左右，其中較大的顆粒粒徑達(dá)到155 nm如圖3h。從圖3i到3k可以看到SEA活化后細(xì)胞周圍同樣有豐富的蹼狀結(jié)構(gòu)和偽足結(jié)構(gòu)(圖中虛線和箭頭所示)，從圖3l可以看出SEA活化后 T細(xì)胞的高度為 2.71μm，半高寬為5.31μm。從 AFM高分辨的圖像可以看出，SEA活化后膜納米結(jié)構(gòu)變的復(fù)雜，表面起伏不平，與PHA活化的現(xiàn)象類似同樣有顆粒狀團簇的形成，團簇大小100 nm ～1μm(圖3m和3n)，膜表面摩擦力的分布也變的不均勻(圖3o)，組成團簇的顆粒大小在15～120 nm之間，呈正態(tài)分布，顆粒大小主要集中在75 nm左右，其中較大的顆粒達(dá)到134 nm(圖3p)。

為了對活化前后T細(xì)胞形態(tài)與膜納米結(jié)構(gòu)進行定量對比分析，我們對關(guān)于細(xì)胞形態(tài)的各項物理參數(shù)做了統(tǒng)計分析，如圖4所示，這些物理參數(shù)主要包括:細(xì)胞體積、細(xì)胞直徑、細(xì)胞高度、膜表面平均粗糙度及膜表面納米顆粒高度分布等五個指標(biāo)。統(tǒng)計結(jié)果直觀的表明:細(xì)胞經(jīng)PHA和SEA刺激活化后，細(xì)胞的高度增加，細(xì)胞的直徑和體積也均增大，其中體積增加幅度較大(如圖4a和4b)。對于膜表面納米結(jié)構(gòu)而言，其表面平均粗糙度略有增加但變化并不明顯，靜息的T細(xì)胞Ra為6 nm左右，PHA活化后Ra增加到8 nm左右，SEA活化后Ra增加到近10 nm，而膜表面顆粒的平均高度則明顯增大，靜息的T細(xì)胞表面顆粒高度為42 nm左右，PHA活化后顆粒高度增加到78 nm左右，SEA活化后顆粒高度增加到近91 nm左右(如圖4c所示)，這與其超微結(jié)構(gòu)的變化(圖2e到圖3e和圖3m)相吻合。需要說明的是經(jīng)SEA活化后細(xì)胞體積、細(xì)胞直徑、細(xì)胞高度、膜表面平均粗糙度及膜表面納米顆粒高度這五項指標(biāo)的增加幅度均大于PHA活化后的，這說明不同的刺激劑對T細(xì)胞的活化程度不同從而會導(dǎo)致不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和膜納米結(jié)構(gòu)。

圖4 對活化前后T細(xì)胞的形貌及膜表面納米結(jié)構(gòu)進行定量分析包括細(xì)胞體積，我們統(tǒng)計了其細(xì)胞體積(圖a)，半高寬和細(xì)胞高度(圖b)，以及膜納米結(jié)構(gòu)變化的參數(shù)平均粗糙度(Ra)和顆粒平均高度(圖c)的變化Fig.4 Quantitative analysis of morphology and nanostructure about resting and activated T cells.A statistics of cell volume(a)，cell height(b)，full width at half maximum(FWHM)(b)，average roughness(Ra)(c)and particle average height(c)was performed

2.3 不同外源刺激下T細(xì)胞膜納米力學(xué)特性的變化

T細(xì)胞的活化實驗采用PHA和SEA刺激T細(xì)胞活化。我們知道，植物凝集素(PHA)是一種從紅蕓豆中提取的有絲分裂原，作為一種低聚糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，植物凝集素有促進淋巴細(xì)胞有絲分裂、激活免疫細(xì)胞--淋巴細(xì)胞的作用。PHA刺激T細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞;效應(yīng)T細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量細(xì)胞因子(如白介素-2、干擾素等)殺傷病毒［12］。超抗原(SEA)是一種蛋白激酶C的激活劑，可直接與 T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的某些Vβ區(qū)結(jié)合，不受主要組織相容性復(fù)合物(major histocompability complex，MHC)的限制，導(dǎo)致帶有特異性Vβ節(jié)段的 T細(xì)胞大量活化增［13］。

免疫是機體針對外源性物質(zhì)的防御性反應(yīng)。任何外源性物質(zhì)首先侵入的是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜已經(jīng)被證明參與刺激性或者細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，所以細(xì)胞膜的改變被認(rèn)為是在分子水平上對細(xì)胞行為的影響［14］。我們前面的觀察結(jié)果表明了T細(xì)胞形貌及膜表面納米結(jié)構(gòu)在經(jīng)PHA和SEA刺激活化后發(fā)生改變，由于特異性膜分子的表達(dá)和分泌細(xì)胞因子等導(dǎo)致細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)等大分子明顯增多，從而引起細(xì)胞膜納米結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化。而細(xì)胞膜受到干擾或破壞，通過一定的途徑觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞粘著，即增強細(xì)胞間的粘連及細(xì)胞與基質(zhì)的粘連，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀和細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)。T細(xì)胞面對外源侵入，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞，其粘附力的大小直接決定著細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。另一方面細(xì)胞膜表面蛋白等大分子含量的改變會導(dǎo)致細(xì)胞硬度的改變。細(xì)胞膜表面分子的變化可能會引起其力學(xué)特性的變化，這必然是與其免疫功能相適應(yīng)的。以往的研究結(jié)果表明，細(xì)胞形態(tài)將會影響其機械性能［15，16］，這表明，不同的形態(tài)則有著不同的機械性能。但是在AFM之前，人們還無法在納米尺度獲取細(xì)胞膜納米力學(xué)特性變化的參數(shù)［17］，AFM作為獲得生物分子和細(xì)胞的納米結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性的強有力的工具，早已被證明是一種強有力的非破壞性的納米技術(shù)，AFM這一納米力感應(yīng)器的出現(xiàn)，從而成為研究細(xì)胞動力學(xué)過程的新工具［18-21］。

圖5 AFM針尖-細(xì)胞力測量結(jié)果。圖a是利用AFM探針獲得的玻璃表面非特異性作用的力曲線。圖b、圖c和圖d分別是AFM針尖和靜息的T細(xì)胞、SEA活化的細(xì)胞和PHA活化的細(xì)胞之間的非特異性的力曲線。圖e、圖f和圖g分別為靜息的、SEA活化的和PHA活化的T細(xì)胞膜表面粘附力的統(tǒng)計圖Fig.5 Measurement of the adhesion force of AFM tip-T cells，(a)Force-distance curve between AFM tip and glass surface，(b)Force-distance curve of resting T cells，(c，d)Force-distance curves of T cells which were activated by SEA and PHA for 48h，respectively.(e，f，g)Histograms of statistical results of surface adhesion force for resting groups，SEA groups and PHA groups，respectively

圖5a是針尖與玻璃表面的力曲線，玻璃表面與探針的作用力不明顯，從圖5b可以看出Resting T細(xì)胞表面與探針間具有明顯的粘附力。圖5c是SEA刺激48h后，針尖和T淋巴細(xì)胞表面的力曲線，與靜息的T細(xì)胞相比，SEA活化后粘附力增大;圖5d是PHA刺激后T淋巴細(xì)胞與針尖之間的力曲線，與靜息的T細(xì)胞和SEA活化的T細(xì)胞相比，PHA活化后細(xì)胞表面粘附力變得更大。通過定量分析可知AFM針尖與靜息的(圖5e)、SEA活化的(圖5f)和PHA活化的(圖5 g)T細(xì)胞之間的作用力分別為70 pN、250 pN和380 pN。T淋巴細(xì)胞在經(jīng)過不同抗原刺激后，不但細(xì)胞形態(tài)和膜納米結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而且這種變化還伴隨著細(xì)胞膜納米機械性能的變化。不同的抗原刺激會導(dǎo)致粘附力的增加幅度不同，通過上面的分析可知PHA活化后T細(xì)胞表面的粘附力增加幅度較大。經(jīng)抗原刺激活化后細(xì)胞表面的粘附力為靜息的細(xì)胞表面的粘附力的3-6倍。T細(xì)胞正是通過以上途徑，把與外源性物質(zhì)作用后的變化表現(xiàn)在細(xì)胞微觀形貌上，這種變化進一步導(dǎo)致功能的變化，T細(xì)胞的這種變化形式可能使得其更加有效的與病原體相互作用從而進一步清除病原體。結(jié)合T淋巴細(xì)胞的超微形貌圖，靜息的T細(xì)胞膜表面較為平坦時，細(xì)胞的粘附力較小，當(dāng)活化后隨著膜分子的表達(dá)，細(xì)胞膜成分團聚形成顆粒時粘附力則隨之增大。另一方面，前面的倒置顯微鏡圖1c到圖1f，顯示活化后細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，這種凝集作用依賴于LFA-1/ICAM-1的相互作用，靜息T淋巴細(xì)胞表面粘附分子LFA-1/ICAM-1結(jié)合較弱，T淋巴細(xì)胞在受到外來抗原刺激作用活化后，LFA-1/ICAM-1的結(jié)合顯著增強［27］。T細(xì)胞經(jīng)PHA活化后粘附力較SEA活化后粘附力大，與前面的倒置顯微鏡所顯示的結(jié)果一致，即PHA活化后細(xì)胞凝聚團簇較SEA活化后細(xì)胞凝聚團簇大而且凝聚團簇多，這可能是PHA活化后LFA-1/ICAM-1的親和力更強的緣故。已有大量研究證明活化后細(xì)胞表面LFA-1/ICAM-1這兩種粘附分子的表達(dá)并沒有顯著增加，上述事實提示在T淋巴細(xì)胞活化后，粘附分子可能通過構(gòu)型變化的方式，提高LFA-1/ICAM相互作用的親和力，從而提高活化淋巴細(xì)胞的粘附能力［22-24］。我們可以利用力曲線探針與樣品接觸部分的斜率變化來分析樣品表面的硬度變化，即δy/δx的比值越大，其硬度也越大。比較圖5a和5b可以看出玻璃表面的硬度較細(xì)胞表面的硬度大，與靜息的T細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)SEA活化后(圖5c)和PHA活化后(圖5d)所測得的斜率要小于對靜息細(xì)胞所測得的斜率，因為曲線斜率與細(xì)胞硬度具有相關(guān)性［25］，因此斜率變小意味著活化后T細(xì)胞的硬度變小，這可能與細(xì)胞在受到抗原刺激后的變形能力有關(guān)，如更容易伸出偽足等，同時細(xì)胞硬度減小有利于細(xì)胞的運動，從而更有利于與靶細(xì)胞等相互作用。

3 討論

細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與機械性能對細(xì)胞的生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)過程起著重要的作用，如細(xì)胞表面顆粒及分子的分布，細(xì)胞的增殖、活化、凋亡、信號傳導(dǎo)等均與細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與機械性能相關(guān)。原子力顯微鏡這一科學(xué)研究工具不僅在細(xì)胞形態(tài)和膜納米結(jié)構(gòu)研究中具有極大應(yīng)用價值，而且在生物樣品，如細(xì)胞、生物大分子等納米力學(xué)測量等方面也具有無可比擬的優(yōu)勢。

T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，機體一旦受到病原體的攻擊，T細(xì)胞會迅速做出反應(yīng)，從而導(dǎo)致其處于活化增殖狀態(tài)。我們首先利用PHA和SEA刺激活化T細(xì)胞，啟動機體多種免疫反應(yīng)，并應(yīng)用AFM的高空間分辨率比較了靜息、PHA活化和SEA活化的T淋巴細(xì)胞的超微形貌結(jié)構(gòu)，并測量了細(xì)胞的納米機械性能。分析靜息的T細(xì)胞和活化的T細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和膜納米結(jié)構(gòu)有利于進一步了解T細(xì)胞活化的機制和免疫突觸的形成以及整個免疫反應(yīng)的過程。分析靜息的T細(xì)胞的AFM圖可以得知，靜息的T細(xì)胞膜表面較光滑(圖2a到2c)，納米結(jié)構(gòu)表明膜表面的分子排列緊密(圖2e和2f)，測量表明膜表面平均粗糙度(Ra)分布為6.7 nm。靜息的細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)比較光滑、緊密，與之對應(yīng)的LFM模式圖也表明靜息細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)光滑的特點，其摩擦力的分布相對均勻(圖2g)，這說明膜表面的各種生物大分子比較均勻的分布于膜表面，這與我們前面的成像結(jié)果相符合。雖然靜息的T細(xì)胞表面大部分地方摩擦力相同且較小，但是有的地方摩擦力要高于周圍的摩擦力，有的地方摩擦力低于周圍的摩擦力這是由于細(xì)胞表面顆粒高度的不同(圖2h)和細(xì)胞膜成分的不同引起的。與靜息的T細(xì)胞相比，經(jīng)過PHA和SEA活化后，細(xì)胞的高度和體積明顯增大(圖4)，這是T細(xì)胞經(jīng)過刺激劑活化后增殖、分化而增大的表現(xiàn)。從其納米結(jié)構(gòu)圖(圖3e和3m)可以看出活化后的T細(xì)胞表面布滿顆粒狀團簇(100 nm～1μm)，這些微納結(jié)構(gòu)域可能是在細(xì)胞活化與增殖的過程中，多種細(xì)胞因子和標(biāo)志分子開始表達(dá)分泌，細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)等大分子明顯增多，T細(xì)胞表面分子會由疏散分布轉(zhuǎn)而聚集成簇從而形成免疫突觸［26］，同時T細(xì)胞之間的相互作用和信息傳導(dǎo)也逐漸增加，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)重排形成的具有其特殊功能的膜納米結(jié)構(gòu)域，這對于免疫細(xì)胞的功能發(fā)揮是至關(guān)重要的。

經(jīng)過PHA和SEA活化后的T細(xì)胞表面粘附力增大，是靜息的T細(xì)胞的3-6倍，結(jié)合其超微結(jié)構(gòu)分析，活化后T細(xì)胞表面形成大小不一的顆粒狀物質(zhì)，這些物質(zhì)均為細(xì)胞表面蛋白和脂糖等的聚集物，細(xì)胞的這些形態(tài)變化引起其粘附力的變化;結(jié)合其功能分析，粘附力增大有利于加強T細(xì)胞與病原體的相互作用。另一方面活化后細(xì)胞硬度減小，這可能與細(xì)胞在受到抗原刺激后的變形能力有關(guān)，如更容易伸出偽足等，同時硬度減小有利于細(xì)胞的遷移，從而更有利于與靶細(xì)胞等相互作用從而進一步清除病原體。通過AFM的研究，可以進一步的了解T淋巴細(xì)胞形態(tài)變化與細(xì)胞行為之間的關(guān)系，為更好地理解T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能提供了更多可視化的依據(jù)。

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