向 芬，黃 帥，趙小英，劉選明，朱詠華*

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院，植物基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410082;2.湖南省茶葉研究所，湖南長沙 410125)

植物激素脫落酸 (Abscisic acid，ABA)調(diào)控植物生長和發(fā)育的許多方面，例如:促進(jìn)種子成熟、休眠，抑制種子胚的萌發(fā)、植株根的伸長和葉片氣孔的關(guān)閉等等［1，2］。此外，脫落酸還是一種重要的抗逆誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)植物對逆境如干旱、鹽堿、低溫等生理反應(yīng)，因此對脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行研究對植物生長的調(diào)控具有重要的意義。近年來，與脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的中間體雖然陸續(xù)被揭曉，但對脫落酸的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制了解還較少。

在高等植物中，生物鐘通過振蕩器的作用來調(diào)節(jié)下游功能基因的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控許多錯綜復(fù)雜的新陳代謝和壓力響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的目的［3］。PRRs(pseudoresponse regulators)家族中的 PRR7、PRR9基因是生物鐘振蕩器的核心成員［4，5］。有研究發(fā)現(xiàn)，植物信號網(wǎng)絡(luò)包括ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受內(nèi)源生物鐘節(jié)律調(diào)節(jié)，受ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控的冷脅迫、氣孔運動同時也受生物鐘的調(diào)控［6］。有研究表明，在野生型植株中ABA含量黎明時較低，在中午12點增加了2倍，但是在prr9/7/5三缺失突變體中ABA含量一直很高，說明PRR9/7/5抑制了生物合成ABA途徑［3］。因此，生物鐘振蕩器的核心成員PRR7、PRR9與同是PRRs家族的PRR5可能為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因。

為了探討PRR5基因是否為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因。本研究比較分析了外源ABA對prr5突變體種子萌發(fā)、根長生長的影響，以及外源ABA對PRR5基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，并驗證了NaCl對prr5突變體種子萌發(fā)的影響，進(jìn)一步闡明PRR5基因在擬南芥中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥［Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.］哥倫比亞生態(tài)型野生型(WT)Col-0為湖南大學(xué)生物學(xué)院植物分子生物學(xué)實驗室保存。Col-0背景的prr5缺失突變體純合子由美國加州大學(xué)洛杉磯分校林辰濤實驗室贈送。擬南芥種子用70%乙醇滅菌30 s，10%次氯酸鈉滅菌10 min，無菌水沖洗4～5次，于黑暗下4℃春化4 d后，再用0.1%的瓊脂懸液懸浮種子后點播在含0.8%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基上，置于22℃全日照光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［7］。

1.2 方法

1.2.1 ABA處理 種子萌發(fā)試驗，把春化后的野生型和 prr5突變體種子點播于不同濃度(0、0.3、0.6、0.9、1.2μmol·L-1)ABA、不同濃度(0、50、100、150 mmol·L-1)NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，連續(xù)7 d觀察統(tǒng)計各種子的萌發(fā)及萌發(fā)后生長情況［8，9］。根長試驗，把在MS固體培養(yǎng)基上生長6 d的幼苗轉(zhuǎn)移到含不同 ABA 濃度(0、0.1、1、10、50μmol·L-1)的MS固體培養(yǎng)基上生長6 d后再測量根長。數(shù)據(jù)作圖采用Microsoft Excel 2003，數(shù)據(jù)分析采用 DPS v7.55系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析。表達(dá)分析處理試驗，取生長7 d的擬南芥Col-0幼苗，根部分別置于含不同濃度(0、1、10、50、100μmol·L-1)ABA 的 MS 液體培養(yǎng)基中處理4 h，上述處理后的幼苗以液氮速凍，保存于-80℃冰箱中用于目標(biāo)基因的表達(dá)分析［8］。

1.2.2 RNA 提取 按Easy Way RNA Mini Kit試劑盒(安比奧生物技術(shù)有限公司)說明書提取不同濃度ABA處理過的Col-0幼苗總RNA，按照Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase Instruction說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA［10］。該合成鏈作為 RT-PCR的模板，用于檢測PRR5基因的表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.2.3 實時熒光定量 PCR(real time quantitative PCR)反應(yīng)體系 RT-PCR以上述合成的cDNA為模板，反應(yīng)體系為 20μL，包括雙蒸水 10.8μL，10 × 緩沖 液 2μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL，MgCl21.6μL，引物各 0.1μL，SYBR Green I 0.5μL，ROX 0.1μL，2.5 U·μL-1Jump Start Taq 聚合酶(Sigma)0.4μL，cDNA 模板 4μL。其中，ROX 為被動參考染料。反應(yīng)程序為95℃ 10 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。試驗數(shù)據(jù)采用 MxPro軟件(Stratagene)進(jìn)行分析［11］。ACT2的表達(dá)水平被用作均一化的內(nèi)參，未經(jīng)ABA處理過的樣本作為參比樣本，檢測樣品均為3次重復(fù)。

表1 實時定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in real time quantitative PCR analysis

2 結(jié)果和分析

2.1 ABA處理對prr5突變體種子萌發(fā)的影響

ABA抑制種子的萌發(fā)，為了初步確定prr5突變體是否與ABA信號調(diào)控關(guān)聯(lián)，將野生型與prr5突變體播種在含不同濃度(0、0.3、0.6、0.9、1.2μmol·L-1)ABA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后對種子萌發(fā)率及子葉變綠率進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖1顯示，經(jīng)不同濃度ABA處理7 d后，prr5種子萌發(fā)率較野生型高，除0.3μmol·L-1濃度呈顯著差異，其他濃度都呈極顯著差異，即表示prr5對ABA弱敏感。prr5突變體子葉變綠率在 ABA濃度為0.3μmol·L-1以下比野生型高。同時，將prr5突變體種子點播于含不同濃度(0.3、0.9μmol·L-1)ABA 的 MS 固體培養(yǎng)基上，連續(xù)5 d觀察統(tǒng)計種子的萌發(fā)情況。從圖2可以看出，prr5 種子的萌發(fā)率在 ABA 濃度為0.3、0.9μmol·L-1時一直較野生型高，其中，在 ABA濃度為0.3μmol·L-1的MS培養(yǎng)基上突變體萌發(fā)率呈顯著或極顯著增加，在 ABA 濃度為 0.9μmol·L-1上第 2、3 d 其萌發(fā)率都存在極顯著差異。

圖1 外源ABA對prr5突變體種子萌發(fā)率(A)及萌發(fā)后生長(子葉變綠率B)的影響Fig.1 Effects of exogenous ABA on germination inhibition(A)and post-germination growth(green cotyledons B)of prr5 mutant and wild-type seeds

圖2 prr5突變體和野生型在ABA濃度為0.3(A)、0.9(B)μmol·L-1的 MS培養(yǎng)基上生長1、2、3、4、5 d 的萌發(fā)率Fig.2 Germination efficiency of wild type and prr5 mutant seeds on day 1 to day 5 with 0.3(A)and 0.9(B)μmol·L-1ABA treatment

2.2 ABA對prr5突變體幼苗主根伸長的影響

ABA對主根伸長有抑制作用，為了進(jìn)一步從表型上探討PRR5基因是否與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)聯(lián)，將在MS固體培養(yǎng)基上生長6 d的幼苗轉(zhuǎn)移到含不同濃度(0、0.1、1、10、50μmol·L-1)ABA 的 MS 固體培養(yǎng)基上，6 d后測量主根長度，從圖3可以看出，經(jīng)不同濃度ABA處理后，prr5突變體的主根長度都較野生型長，其中猶以1、50μmol·L-1ABA 濃度處理后突變體主根呈顯著、極顯著增長，即prr5也表現(xiàn)出對ABA弱敏感。

2.3 ABA對PRR5基因相對表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗證PRR5基因是否與ABA信號途徑關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步從表達(dá)水平上檢測prr5是否受ABA調(diào)控。將擬南芥野生型7 d齡幼苗用不同濃度(0、1、10、50、100μmol·L-1)ABA 分別處理后，用實時定量PCR的方法對處理后幼苗中prr5的表達(dá)進(jìn)行了分析，從圖4可以看出，低濃度ABA對PRR5基因表達(dá)的抑制作用明顯，隨濃度增加，抑制作用下降，但表達(dá)量均比未經(jīng)過ABA處理的要低，到100μmol·L-1濃度時跟未經(jīng)過處理的對照表達(dá)量基本一致，即PRR5基因表現(xiàn)出在高濃度時對ABA弱敏感。

圖3 外源ABA對prr5突變體和野生型幼苗主根伸長的影響。野生型與prr5突變體幼苗在不含ABA的MS固體培養(yǎng)基上生長6天后轉(zhuǎn)移到含不同濃度(0，0.1，1，10，50μmol·L-1)ABA 的 MS 固體培養(yǎng)基上生長6天的根長生長情況Fig.3 Effects of exogenous ABA on the roots growth of prr5 mutant and wild-type seedlings.Sensitivity of root growth to ABA of the wild type and prr5 mutant，which are grown for 6 days on ABA-free medium and then incubated vertically for 6 days on medium with 0，0.1，1，10 or 50μmol·L-1ABA，respectively

圖4 不同濃度ABA處理擬南芥幼苗后PRR5基因的表達(dá)Fig.4 The expression profiles of prr5 gene in seedling in response to different concentrations of ABA

2.4 NaCl處理對prr5突變體種子萌發(fā)的影響

脫落酸是一種重要的抗逆誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)植物對逆境如干旱、鹽堿、低溫等生理反應(yīng)。為了研究prr5突變體對鹽脅迫是否產(chǎn)生反應(yīng)，將突變體及野生型種子培養(yǎng)在含不同濃度(0、50、100、150 mmol·L-1)NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)生長7 d后統(tǒng)計分析種子萌發(fā)率及子葉變綠率。圖5顯示，在不含NaCl的MS固體培養(yǎng)基上生長7 d后的種子萌發(fā)率、子葉變綠率與野生型相一致，但prr5突變體在含50、100、150 mmol·L-1NaCl MS固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率、子葉變綠率都比野生型的高，且均達(dá)到極顯著水平，猶以在含150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上生長變化最明顯。

圖5 外源NaCl對prr5突變體和野生型萌發(fā)率(A)及萌發(fā)后生長(子葉變綠率B)的影響Fig.5 Effects of exogenous NaCl on germination(A)and post-germination growth(green cotyledons B)of prr5 mutant and wild-type seeds

3 討論

脫落酸是一種重要的植物激素，具有廣泛的生理功能，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［12］。該信號網(wǎng)絡(luò)能被生物鐘節(jié)律調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)生物鐘核心振蕩器成員PRR5、PRR7、PRR9的三缺失突變體prr9/7/5對ABA生物合成具有抑制作用。本研究用ABA處理prr5突變體及野生型，發(fā)現(xiàn)prr5突變體種子萌發(fā)率比野生型顯著或極顯著增高，主根比野生型長，即對ABA弱敏感。對野生型進(jìn)行不同濃度ABA處理，發(fā)現(xiàn)PRR5基因表達(dá)受抑制，因此推測該基因可能為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因。同時，對prr5突變體與野生型種子進(jìn)行NaCl處理，prr5突變體種子的萌發(fā)率比野生型極顯著增高，說明PRR5基因可能參與鹽脅迫調(diào)節(jié)，由于ABA作為一種重要的抗逆誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)植物對逆境如干旱、鹽堿、低溫等生理反應(yīng)，NaCl處理實驗從側(cè)面驗證了PRR5基因?qū)BA的響應(yīng)。

TOC1 也屬于 PRRs基因家族［13，14］。有研究指出，TOC1是一個聯(lián)系生物鐘和干旱脅迫的分子開關(guān)，TOC1-ox受干旱存活率比野生型低，TOC1 RNAi存活率比野生型的高［15］。Castells等［16］研究認(rèn)為TOC1調(diào)控ABA相關(guān)基因ABAR/CHLH/GUN5的表達(dá)是通過結(jié)合它的啟動子來進(jìn)行的，同時發(fā)現(xiàn)toc1-2突變體經(jīng)ABA處理后的萌發(fā)率比野生型高，TOC1-ox突變體的萌發(fā)率比野生型低。因此，PRRs基因家族的其它成員有可能為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因。本試驗證明了PRR5參與了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。prr5缺失突變體受ABA處理后的萌發(fā)率比野生型高，prr5缺失突變體的根長伸長也比野生型長，都表現(xiàn)出對ABA弱敏感，與上述toc1-2突變體對ABA處理后的結(jié)果相一致。因此，我們推測PRR5基因也可能通過調(diào)控ABA信號相關(guān)基因參與ABA信號途徑，我們將在今后作更深入的研究。

［1］KUCERA B，COHN M A，LEUBNER-METZGER G.Plant hormone interactions during seed dormancy release and germination［J］.Seed Science Research，2005，15:281-307.

［2］KERMODE A R.Role of abscisic acid in seed dormancy［J］.J Plant Growth Regulation，2005，224:319-344.

［3］FUKUSHIMA A，KUSANO M，NAKAMICHI N，et al.Impact of clock associated Arabidopsis pseudo-response regulators in metabolic coordination［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(17):7251-7256.

［4］CTAKAT A N，SAITO S，SAITO C T，et al.Phylogenetic footprint of the plant cock system in angiosperms:evolutionary processes of pseudo-response regulators［J］.BMC Evolutionary Biology，2010，10:126.

［5］NAKAMICHI N，KIBA T，HENRIQUES R，et al.PSEUDORESPONSE REGULATORS 9，7，and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock［J］.Plant Cell，2010，22:594-605.

［6］ROBERTSON F C，SKEFFINGTON A W，GARDNER M J，et al.Interactions between circadian and hormonal signaling in plants［J］.Plant Molecular Biology，2009，69:419-427.

［7］王會，金宇騑，盧曼曼，等.擬南芥RopGEFs家族基因在外源脫落酸處理下的表達(dá)分析［J］.植物生理通訊，2010，46(8):817-823.WANG Hui，JIN Yufei，LU Manman，et al.Expression analysis of ROPGEFS genes in Arabidopsis thaliana treated with ABA［J］.PlantPhysiologyCommunications，2010，46(8):817-823.

［8］GUO X H，DENG K Q，WANG J，et al.Mutational analysis of Arabidopsis PP2CA2 involved in abscisic acid signal transduction［J］.Molecular Biology Reports，2010，37:763-769.

［9］SAEZ A，ROBERT N，MOHAMMAD H，et al.Enhancement of abscisic acid sensitivity and reduction of water consumption in Arabidopsis by combined inactivation of the protein phosphatases type 2C ABI1 and HAB1［J］.Plant Physiology，2006，114(4):1389-1399.

［10］劉實，趙小英，唐冬英，等.擬南芥CIPK1基因的功能初步分析［J］.西北植物報，2007，27(6):1091-1095.LIU Shi，ZHAO Xiaoying，TANG Dongying，et al.The function of CIPK1 gene in Arabidopsis［J］.Acta Botanica Boreal-Occidentalia Sinica，2007，27(6):1091-1095.

［11］鄧克勤，郭新紅，汪啟明，等.擬南芥磷酸酶基因亞細(xì)胞定位與組織表達(dá)［J］.西北植物學(xué)報，2009，29(2):234-239.DENG Keqin，GUO Xinhong，WANG Qiming，et al.Subcellular localization and tissue expression pattern of Arabidopsis phosphatase gene［J］.Acta Botanica Boreal-Occidentalia Sinica，2009，29(2):234-239.

［12］郭振清，郭曉強.脫落酸的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［J］.生命的化學(xué)，2007，27(6):482-484.GUO Zhengqing，GUO Xiaoqiang.ABA signal transduction pathway［J］.Chemistry of Life，2007，27(6):482-484.

［13］PARA A，F(xiàn)ARRE E M，IMAIZUMI T，et al.PRR3 is a vascular regulator of TOC1 stability in the Arabidopsis circadian clock［J］.Plant Cell，2007，19:3462-3473.

［14］ERIKSSON M E，HANANO S，SOUTHERN M M，et al.Response regulator homologues have complementary light-dependent functions in the Arabidopsis circadian clock［J］.Planta，2003，218:159-162.

［15］LEGNAIOLI T，CUEVAS J，MAS P.TOC1 functions as a molecular switch connecting the circadian clock with plant responses to drought［J］.The EMBO Journal，2009，28:3745-3757.

［16］CASTELLS E，PORTOLéS S，HUANG W，et al.A functional connection between the clock component TOC1 and abscisic acid signaling pathways［J］.Plant Signaling ＆ Behavior，2010，5(4):409-411.