溫賢濤，賀學(xué)英，李劍，湯菊莉，黃永富

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京市，101111

0 前言

醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)中樣品制備是生物學(xué)試驗(yàn)的第一步，是生物學(xué)試驗(yàn)成功開展的前提，是確保生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠的保證。醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)GB/T1688-12對(duì)樣品制備條件進(jìn)行了推薦，在生物學(xué)試驗(yàn)中常需要使用樣品浸提液進(jìn)行試驗(yàn)，即將試驗(yàn)樣品浸入適宜的介質(zhì)中，在一定的條件下進(jìn)行浸提，然后使用浸提液進(jìn)行一系列的生物學(xué)試驗(yàn)，其目的在于檢測(cè)醫(yī)療器械可溶出物可能導(dǎo)致的生物學(xué)反應(yīng)，以評(píng)價(jià)產(chǎn)品可能對(duì)病人或使用者的潛在危害。系列標(biāo)準(zhǔn)第12部分對(duì)浸提法原理進(jìn)行了說明，并對(duì)浸提容器、浸提介質(zhì)、浸提條件和方法等均進(jìn)行了推薦，此方法主要參考藥包材的浸提方法[1-4]。但由于醫(yī)療器械的材料、預(yù)期用途、使用方法等與藥包材有很大區(qū)別，加上醫(yī)療器械本身的多樣性，試驗(yàn)人員應(yīng)該根據(jù)樣品的物理化學(xué)特性等選擇相應(yīng)的浸提條件和方法。目前關(guān)于樣品制備條件的研究國內(nèi)外均開展得不多，可能是由于醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體系的建立相對(duì)較晚，加上醫(yī)療器械的多樣性，醫(yī)療器械材料種類眾多，物理化學(xué)性能相差很大，一一進(jìn)行研究，時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本均太高。

本文以鎳鈦合金材料作為研究對(duì)象，進(jìn)行不同浸提條件下鎳溶出的比較研究。近三十年來，鎳鈦合金以其良好的生物相容性、形狀記憶效應(yīng)和超彈性等特點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域[5]。但是由于鎳鈦合金中鎳含量高，鎳溶出是影響鎳鈦合金生物相容性的一個(gè)重要因素[6]。本研究選擇兩家醫(yī)用鎳鈦合金生產(chǎn)廠家提供的鎳鈦合金絲，以生理鹽水作為浸提介質(zhì)，分別在GB/T 16886-12推薦的五種條件下進(jìn)行浸提，采用等離子發(fā)射光譜儀（ICP）分析方法檢測(cè)浸提液中鎳濃度，比較不同浸提條件對(duì)鎳溶出的影響，選擇最優(yōu)的浸提條件。同時(shí)，計(jì)算單位質(zhì)量和單位面積下每天鎳離子析出量，根據(jù)GB/T 16886.17推薦的過程[7]，與目前國際已知的鎳毒性限量進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)鎳鈦合金的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

選用直徑為2mm的鎳鈦合金(Ni/ Ti:55/45)，記材料編號(hào)為GM和JS，分別由供應(yīng)商A和B提供。

1.2 試劑

生理鹽水、蒸餾水、乙醇、多元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100.0 μg/mL)。

1.3 儀器

iCAP6000等離子發(fā)射光譜儀、分析天平、超聲清洗儀、烘箱。

1.4 方法

1.4.1 材料制備

鎳鈦合金絲截成10 mm，用自來水清洗三次，蒸餾水超聲清洗5 min，再用乙醇清洗一次，最后蒸餾清洗三次，37oC烘箱中烘干，干燥器放置24 h以上備用。用10 ml玻璃瓶為容器，稀酸稀堿浸泡后，自來水和蒸餾水分別清洗三次后，37oC烘箱中烘干備用。

1.4.2 浸提

稱取一定量的鎳鈦合金段放入玻璃瓶，按0.2 g/mL的浸提比例加入生理鹽水，在不同浸提條件下進(jìn)行浸提，每個(gè)浸提條件設(shè)三個(gè)平行樣。浸提結(jié)束后，將鎳鈦合金取出，浸提液備用。

1.4.3 鎳濃度分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用100 μg/mL 多元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成100 μg/L，200 μg/L 及300 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，上機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

濃度分析：進(jìn)樣管直接取浸提原液進(jìn)行分析，結(jié)果取三個(gè)平行樣的平均值。

2 結(jié)果與討論

GM與JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳離子溶出濃度如表1、表2所示。

表1 GM鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.1 The dissolution of nickel of GM nitinol under different extraction conditions

據(jù)表1、表2的鎳溶出情況，可以得出以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(1) 不同浸提條件下所制備浸提液中鎳離子濃度不同。相同溫度條件下，延長(zhǎng)浸提時(shí)間，浸提液中鎳離子濃度增加。相同浸提時(shí)間下，浸提溫度越高，鎳離子濃度增加。可見鎳離子的溶出與浸提時(shí)間和溫度成正相關(guān)。(121oC,1 h)浸提條件，雖然溫度最高，但由于浸提時(shí)間很短，因此析出的離子較少。(50oC,72 h)及70oC,24 h)這兩個(gè)浸提條件，溶出離子均明顯高于(37oC,72 h)浸提條件下溶出的離子量，對(duì)于GM這種材料(70oC,24 h)溶出離子濃度近(37oC,72 h) 條件下的兩倍。(2) 雖然不同浸提條件下GM和JS兩種材料析出離子濃度的趨勢(shì)是一樣的，但同樣浸提條件下析出離子量相差幾百甚至上千倍。(3) 按WHO 1998年報(bào)告中數(shù)據(jù)，每人每天從食物獲得的鎳量為(86～406) μg，從水中獲得的鎳量為(5～25) μg[6]。例如用鎳鈦合金材料制備封堵器約0.5 g或冠脈支架約0.1 g，由于總質(zhì)量和表面積小，按此實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)推算，可判斷這類器械鎳溶出在安全限量以內(nèi)。

表2 JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.2 The dissolution of nickel of JS nitinol under different extraction conditions

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要考查了不同浸提條件下鎳鈦合金材料鎳溶出的情況，同時(shí)也比較了不同供應(yīng)商提供的鎳鈦合金鎳溶出情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，16886.12中推薦的五種浸提條件對(duì)于鎳鈦合金材料沒有等效性，其中(121oC,1 h)浸提條件下，鎳離子溶出最少，建議今后鎳鈦合金材料的醫(yī)療器械產(chǎn)品生物學(xué)試驗(yàn)浸提液制備盡量不選擇該浸提條件，以免不能充分浸提材料中的有害物質(zhì)。鎳溶出量受浸提時(shí)間和溫度的共同影響，沒有特殊情況時(shí)，常規(guī)浸提建議選擇(37oC,72 h)浸提條件，因?yàn)樵摻釡囟茸罱咏梭w實(shí)際溫度，更能模擬臨床應(yīng)用時(shí)的實(shí)際情況，72 h的浸提時(shí)間比24 h更為充分。(70oC,24 h)條件下離子濃度最高，此條件可作為加速或加嚴(yán)浸提時(shí)選擇的浸提條件，可以縮短浸提時(shí)間，并且鎳溶出量最高。此外，如果使用(70oC,24 h)條件制備的浸提液，在進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，可考慮按比例減少浸提液的用量，得到與(37oC,72 h)條件等效的結(jié)果。比如在開展慢（亞慢）性毒性試驗(yàn)，可減少浸提液的使用量，即減少樣品用量，也盡可能考慮到動(dòng)物福利的要求，減少每日給藥量，減少動(dòng)物痛苦。根據(jù)目前能查到的鎳毒理數(shù)據(jù)，結(jié)合該實(shí)驗(yàn)中鎳溶出量檢測(cè)結(jié)果，可以基本確定鎳鈦合金材料是生物安全的，如果一種醫(yī)療器械設(shè)計(jì)時(shí)含有較大質(zhì)量的鎳鈦合金材料，應(yīng)該慎重。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是在體外靜態(tài)浸提條件下得到的，相比體內(nèi)的生理環(huán)境較為簡(jiǎn)單，因此在對(duì)鎳鈦合金醫(yī)療器械進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，應(yīng)充分考慮體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，如各種無機(jī)離子、酶等蛋白質(zhì)以及一些特定的生物力學(xué)環(huán)境等。因此應(yīng)在下一步實(shí)驗(yàn)中開展體內(nèi)試驗(yàn)，從全身毒性和局部反應(yīng)等方面進(jìn)行研究，特別是考察鎳鈦合金材料長(zhǎng)期植入后的鎳的代謝分布及對(duì)局部組織的影響。此外，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)即使同樣是鎳鈦合金材料，供應(yīng)商不同，產(chǎn)品的性能差別很大，鎳溶出可以相差幾百甚至上千倍。因此，建議醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)選擇供貨商時(shí)，根據(jù)預(yù)期產(chǎn)品性能要求及預(yù)期用途，對(duì)供應(yīng)商進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。

[1]ISO 10993-12-2007 Biological evaluation of medical devices-Part 12:Sample preparation and reference materials [S].

[2]ISO 10993-1-2009 Biological evaluation of medical devices-Part 1:Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3]GB/T 16886.1-2001 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分:評(píng)價(jià)與試驗(yàn)[S].

[4]GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分:樣品制備與參照樣品[S].

[5]鄭玉峰,趙連城.生物醫(yī)用鎳鈦合金[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

[6]Mohammed ES,Martha ES,Helge FB.Assessing the biocompatibility of NiTi shape memory alloys used for medical applications[J].Anal Bioanal Chem,2005,381:557-567.

[7]GB/T 16886.17-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第17部分:可瀝濾物允許限量的建立[S].