李天佳，劉昌偉，黃澤彬，倪 冷，來(lái)志超，吳立飛，劉 暴

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100032

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005

動(dòng)脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的疾病，隨著生活水平提高和高脂肪飲食習(xí)慣，現(xiàn)已成為主要的致病和致死原因。粥樣硬化的形成是多因素共同作用的結(jié)果，其主要的病理變化是內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞增生。流行病學(xué)分析表明吸煙是血管粥樣硬化發(fā)生的一個(gè)主要因素。香煙煙霧可引起血管內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂、血管平滑肌細(xì)胞增生以及血栓形成，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成。通過(guò)已有的資料分析香煙煙霧可能是通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖活力而誘發(fā)粥樣硬化［1-2］。c-jun是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，外界刺激從上游信號(hào)通路傳遞至c-jun并激活其功能，進(jìn)而與DNA區(qū)域結(jié)合并參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)。細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在G1-S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮正調(diào)控作用。c-jun對(duì) cyclinD1的啟動(dòng)子具有激活作用，調(diào)節(jié)其表達(dá)［3］。本研究以c-jun和cyclinD1為切入點(diǎn)，探討吸煙誘發(fā)粥樣硬化的機(jī)制。

材料和方法

材料DMEM高糖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司，新生小牛血清購(gòu)自Gibco公司，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物、平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)添加物、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)購(gòu)自Sciencell公司，兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 (smooth muscle cells，SMC)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購(gòu)自日本東仁化學(xué)研究所，抗c-jun抗體、抗p-c-jun(Ser 63)抗體、抗cyclinD1抗體、抗微管蛋白抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、抗GAPDH抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，F(xiàn)lag-cjun、V5-c-jun過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

煙霧染毒劑的制備香煙 (焦油含量10 mg、煙氣煙堿量0.9 mg、煙氣CO量12mg)經(jīng)完全燃燒通入到1×磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)中，6只香煙燃燒煙霧共通入到500 ml PBS中，調(diào)pH至7.4，0.22 μl濾膜過(guò)濾，制備煙霧萃取劑 (cigarette smoke extract，CSE)。此液定為初始原液，－80℃保存待用［4］。

CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化離心后計(jì)數(shù)，以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)基并加入含有CSE的新鮮培養(yǎng)基，并以相應(yīng)濃度加入磷酸鹽緩沖液作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)基后加入含有10%CCK-8的培養(yǎng)基，并設(shè)置加入培養(yǎng)基和CCK-8溶液但無(wú)細(xì)胞的孔為調(diào)零孔。5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)2 h后，測(cè)定450nm處吸光度值 (absorbance，A)。細(xì)胞活力表示為:細(xì)胞活力=［A(CSE孔)－A(調(diào)零孔)］/［A(磷酸鹽緩沖液孔)－A(調(diào)零孔)］，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞培養(yǎng)及染毒細(xì)胞復(fù)蘇后，加入適宜培養(yǎng)基置于5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到80%。隨機(jī)分為染毒組和PBS對(duì)照組，依據(jù)上述測(cè)定細(xì)胞活力時(shí)的濃度分組如下:40%T、20%T、10%T、5%T、2.5%T、1.25%T、0.625%T、40%P、20%P、10%P、5%P、2.5%P(T表示煙霧染毒，P表示PBS對(duì)照)，染毒處理48 h。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于6 cm培養(yǎng)皿中至細(xì)胞融合率達(dá)到80%。3 μg質(zhì)粒加入到180 μl DMEM高糖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 液，5 μl Lipofectamine 2000 加 入 到 180 μl DMEM高糖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，上述兩種液體混合后室溫靜置15 min。待轉(zhuǎn)染細(xì)胞用DMEM高糖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗2次后，加入DMEM高糖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液2 ml，再加入上述質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的混合液，置于5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)6 h后換為完全培養(yǎng)基。

Western blot蛋白檢測(cè)收集細(xì)胞裂解蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制成上樣樣品。采用30%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以濕法轉(zhuǎn)PVDF膜。5%BSA室溫封閉1 h，依據(jù)抗體工作濃度加入一抗，4℃過(guò)夜孵育，Tris-Tween 20緩沖液洗滌3次，每次5 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，Tris-Tween 20緩沖液洗滌3次，每次5 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法底物發(fā)光，X光片曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞增殖活力平滑肌增殖活力在CSE濃度0.625%～10%時(shí)呈現(xiàn)波峰，CSE濃度太高表現(xiàn)毒性作用，染毒濃度太低則不起作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力隨煙霧染毒濃度增加而逐漸降低，在≤5%染毒濃度時(shí)，由于染毒濃度較低，內(nèi)皮細(xì)胞活力維持在一個(gè)平臺(tái)上 (圖1)。

血管平滑肌細(xì)胞的c-jun、p-c-jun與cyclinD1表達(dá)血管平滑肌煙霧染毒或PBS處理48 h后，染毒組和PBS對(duì)照組相比，c-jun的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。p-c-jun在各PBS對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。p-c-jun染毒組相對(duì)于PBS處理組明顯增高 (P＜0.05)，其中10%T至0.625%T染毒濃度組p-c-jun水平呈現(xiàn)波峰，與SMC的CCK-8檢測(cè)的細(xì)胞增殖活力趨勢(shì)吻合。平滑肌細(xì)胞的各PBS對(duì)照組內(nèi)cyclinD1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。平滑肌細(xì)胞的染毒組和PBS對(duì)照組相比，cyclinD1明顯增高(P＜0.05)(圖2)。

圖1 煙霧染毒時(shí)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力Fig 1 Viabilities of vascular smooth muscle cells and endothelial cells exposured to cigarette smoke extract

血管內(nèi)皮細(xì)胞的c-jun、p-c-jun與cyclinD1表達(dá)在48 h后，HUVEC的染毒組和PBS對(duì)照組相比，c-jun差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。p-c-jun在各PBS對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。染毒組的p-c-jun相對(duì)于PBS對(duì)照組明顯降低 (P＜0.05)，而CCK-8測(cè)定的內(nèi)皮細(xì)胞活力在5%～40%時(shí)才顯著降低，在≤5%染毒濃度時(shí)細(xì)胞活力處于平臺(tái)狀態(tài)。HUVEC染毒組和PBS對(duì)照組相比，cyclinD1明顯降低(P＜0.05)(圖3)。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后c-jun、p-c-jun與cyclinD1的表達(dá)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)c-jun的平滑肌細(xì)胞較空白對(duì)照組 c-jun、p-c-jun和cyclinD1表達(dá)明顯增高 (P＜0.05)。V5-cjun和Flag-c-jun兩種標(biāo)簽分別標(biāo)記c-jun過(guò)表達(dá)組的c-jun、p-c-jun和cyclinD1均比空白對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)(圖4)。

圖2 Western blot檢測(cè)煙霧萃取劑對(duì)平滑肌細(xì)胞的影響Fig 2 Effects of cigarette smoke extract on smooth muscle cells by Western blot

圖3 Western blot檢測(cè)煙霧萃取劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響Fig 3 Effects of cigarette smoke extract on endothelial cells by Western blot

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、平滑肌細(xì)胞異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要過(guò)程。流行病研究表明吸煙是粥樣硬化的一個(gè)主要誘因。因此，筆者推測(cè)吸煙與動(dòng)脈粥樣硬化中的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞增殖具有密切聯(lián)系。研究表明在上述兩種細(xì)胞的增殖過(guò)程中，c-jun和cyclinD1發(fā)揮了重要作用［5］。

圖4 過(guò)表達(dá)c-jun質(zhì)粒對(duì)p-c-jun和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的影響Fig 4 Effect of over-expression c-jun on p-c-jun and cyclinD1

c-jun蛋白屬于激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)家庭成員之一，與AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成二聚體，并調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性［6］。c-jun的調(diào)控范圍十分廣泛，能接受多種外界物質(zhì)的影響并被激活，使細(xì)胞對(duì)外界刺激作出適應(yīng)性反應(yīng)。研究指出c-jun是細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)物，可以促進(jìn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成［7］。c-jun蛋白在大多數(shù)靜息態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，以便于快速誘導(dǎo)激活。本研究SMC和HUVEC的c-jun蛋白水平在染毒組和PBS對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明煙霧染毒對(duì)c-jun的基礎(chǔ)表達(dá)量無(wú)明顯作用。c-jun需要磷酸化N端第63和73位絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用［8］。本研究顯示PBS對(duì)SMC和HUVEC的p-c-jun表達(dá)均無(wú)影響，而煙霧染毒卻可以影響c-jun的磷酸化，并且煙霧染毒組的血管平滑肌細(xì)胞p-c-jun較對(duì)照組明顯增高，而煙霧染毒后內(nèi)皮細(xì)胞p-c-jun表達(dá)顯著降低。這與兩種細(xì)胞CCK-8細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果相符，表明煙霧染毒促進(jìn)平滑肌增殖與p-c-jun有密切聯(lián)系。p-c-jun在很多研究中都表明可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖［9］。此外，在SMC中，p-c-jun在染毒濃度1.25%時(shí)即達(dá)到峰值，而其CCK-8檢測(cè)顯示的細(xì)胞活力峰值在2.5%濃度處才達(dá)到峰值。在HUVEC中，染毒組的p-c-jun在低染毒濃度時(shí)即出現(xiàn)明顯降低，而CCK-8測(cè)定的內(nèi)皮細(xì)胞活力在5%～40%時(shí)才顯著降低，表明p-c-jun的變化早于細(xì)胞活力的變化，推測(cè)在p-c-jun變化致細(xì)胞活力改變的過(guò)程中有其他分子的參與。

cyclinDl是一種細(xì)胞周期蛋白，保證細(xì)胞順利由Gl期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖［10］。c-jun可以調(diào)節(jié)cyclinD1的表達(dá)，其對(duì) cyclinD1的啟動(dòng)子具有激活作用，c-jun與cyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子［11］。本研究顯示PBS不影響兩種細(xì)胞的cyclinD1表達(dá)，而經(jīng)香煙煙霧染毒后，平滑肌細(xì)胞cyclinD1明顯增加，而內(nèi)皮細(xì)胞cyclinD1表達(dá)降低，此結(jié)果與CCK-8檢測(cè)的細(xì)胞增殖活力結(jié)果相符，表明煙霧在促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過(guò)程中，周期蛋白cyclinD1發(fā)揮了重要作用。推測(cè)煙霧染毒可能是通過(guò)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞cyclinD1表達(dá)來(lái)促進(jìn)其增殖，這可能是吸煙誘發(fā)粥樣硬化的一個(gè)重要因素。因此，推論煙霧通過(guò)作用于不同細(xì)胞c-jun的磷酸化，進(jìn)而影響周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活力。本研究過(guò)表達(dá)c-jun后，cyclinD1表達(dá)明顯增高，并且cyclinD1的啟動(dòng)子上也有AP-1的結(jié)合位點(diǎn)［12］。已知c-jun的磷酸化上游激酶是c-jun N末端激酶，香煙煙霧是否影響JNK磷酸化c-jun的進(jìn)程需要進(jìn)一步研究。

綜上，目前認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷和SMC過(guò)度增殖是動(dòng)脈粥樣硬化啟動(dòng)和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞并抑制SMC過(guò)度增殖，對(duì)于抑制動(dòng)脈粥樣病變的發(fā)展具有重要作用。本研究煙霧染毒可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，并且發(fā)現(xiàn)在此過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子c-jun磷酸化水平和周期蛋白cyclinD1表達(dá)有明顯的變化，表明二者在吸煙導(dǎo)致的血管粥樣硬化中可能發(fā)揮重要作用。因此針對(duì)p-c-jun和cyclinD1在吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞活力改變上，對(duì)血管粥樣硬化的預(yù)防和治療有重要意義。

(志謝:感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的老師和工作人員提供的指導(dǎo)和幫助)

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