李 靚，崔柳青，王瑞莉，毛麗紅，韓 康，柴丹丹，薛樂(lè)勛#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001 2)河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州 450001

驅(qū)動(dòng)蛋白作為細(xì)胞內(nèi)一類馬達(dá)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中扮演著重要角色。其成員驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ是參與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵動(dòng)力蛋白之一，包括含馬達(dá)結(jié)構(gòu)域的FLA8、FLA10兩個(gè)動(dòng)力亞基及一個(gè)非動(dòng)力亞基KAP，其中FLA8與FLA10兩個(gè)亞基的C端相互纏繞，形成螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)[1]。有研究[2-3]表明鞭毛內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制不僅對(duì)于纖毛的組裝是必要的，而且在組織纖毛產(chǎn)生的信號(hào)通路中也發(fā)揮重要作用。杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞綠藻，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單。由于其具有一對(duì)等長(zhǎng)的鞭毛而常被用作研究鞭毛內(nèi)運(yùn)輸及鞭毛相關(guān)疾病的模式生物。為了篩選參與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸及相關(guān)信號(hào)通路的蛋白，作者以FLA8 C 端為誘餌，采用酵母雙雜交的方法從杜氏鹽藻的cDNA酵母文庫(kù)中篩選與之相互作用的新蛋白。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑杜氏鹽藻購(gòu)自美國(guó)德州大學(xué)，杜氏鹽藻cDNA酵母文庫(kù)為鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室構(gòu)建，EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ 等DNA限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、DNA連接試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司，酵母雙雜交所用載體pGBKT7、菌株Y187和AH109均購(gòu)自Clontech公司，酵母蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，篩選試劑X-α-Gal、3-AT購(gòu)自Sigma公司。

1.2FLA8cDNA片段的擴(kuò)增提取杜氏鹽藻總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，設(shè)計(jì)兩端分別帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的FLA8 C端特異性引物(EcoRⅠ-FLA8：5’-CCGGAATTCGTGGGCAT CAGCGAGGACCA-3’，BamHⅠ-FLA8：5’-CGCGGATC CTCATGCAGGCTTAGAAGACG-3’)，以制備好的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增FLA8 C端的cDNA片段。

1.3pGBKT7-FLA8-C誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建將得到的FLA8 C端PCR產(chǎn)物和載體pGBKT7用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，分別回收大小為1 302 bp和7 300 bp的目的片段，并按照DNA連接試劑盒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pGBKT7-FLA8-C備用。

1.4自激活檢測(cè)按照Clontech小規(guī)模酵母轉(zhuǎn)化說(shuō)明書將構(gòu)建好的pGBKT7-FLA8-C誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入酵母菌株Y187和AH109中，同時(shí)以pGBKT7-53和空載體分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。得到的克隆分別劃線于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上。如果在SD/-His/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在雜交篩選中需加入組氨酸抑制劑3-AT以抑制His泄露。如果在SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則誘餌蛋白對(duì)報(bào)告基因有自激活作用，不適合用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白。

1.5毒性檢測(cè)將含有誘餌表達(dá)載體和空載體的Y187和AH109菌株分別劃線于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑取大小相同的克隆分別接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，測(cè)光密度值。若含誘餌表達(dá)載體的菌株光密度值明顯低于含空載體的菌株，則說(shuō)明誘餌蛋白的存在阻礙了酵母菌株的生長(zhǎng)，該蛋白不適合用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白。

1.6誘餌蛋白表達(dá)情況檢測(cè)按照酵母蛋白提取試劑盒提取酵母蛋白，SDS凝膠電泳，以Myc 小鼠單抗為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗，Western blot檢測(cè)。

1.7酵母雙雜交取1 mL文庫(kù)菌在冰上融化后與預(yù)先活化的Y187(含pGBKT7-FLA8-C質(zhì)粒)菌株共同轉(zhuǎn)接于5 mL 2×YPDA/kanr的液體培養(yǎng)基中，30 ℃緩慢搖晃，20 h后取樣觀察是否有三葉形合子形成，若無(wú)或者量較少，則繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.8雜交結(jié)果篩選雜交后的菌液涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d至克隆出現(xiàn)。挑取單克隆劃線于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/3-AT固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，若所挑取的克隆生長(zhǎng)并表現(xiàn)為藍(lán)色，則按照同樣方法再轉(zhuǎn)接一代；若不再生長(zhǎng)或者只生長(zhǎng)而不變藍(lán)色則是假陽(yáng)性。傳至第五代仍生長(zhǎng)良好且表現(xiàn)為藍(lán)色的克隆即為陽(yáng)性克隆。

1.9篩選結(jié)果鑒定挑取陽(yáng)性菌落細(xì)胞作為模板進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增得到的片段，膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，酶切鑒定，并將菌液送華大基因科技有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1誘餌表達(dá)載體雙酶切鑒定用EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)pGBKT7-FLA8-C質(zhì)粒雙酶切鑒定，電泳后表現(xiàn)出2條條帶，一條約7 300 bp，為線性的pGBKT7載體；另一條約1 300 bp，為插入的FLA8 C端cDNA片段(圖1)，該結(jié)果表明誘餌表達(dá)載體構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序證明其中沒(méi)有發(fā)生突變，可用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

圖1 誘餌表達(dá)載體酶切鑒定

M：DL 10 kb相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGBKT7-FLA8-C質(zhì)粒；2：pGBKT7-FLA8-CEcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切。

2.2自激活檢測(cè)將含有誘餌表達(dá)載體的酵母菌株AH109和Y187在SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-His/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并變藍(lán)，而在SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。提示酵母細(xì)胞存在本底His泄漏，加入3-AT至終濃度為15 mmol/L時(shí)，可以完全抑制His泄漏。

2.3毒性檢測(cè)含誘餌表達(dá)載體和pGBKT7空載體的Y187菌株接種過(guò)夜培養(yǎng)后測(cè)得其光密度值分別為1.25和1.34，表明誘餌蛋白的存在對(duì)酵母菌株無(wú)毒性。

2.4雙雜交配子形成檢測(cè)雜交20 h時(shí)取樣用顯微鏡觀察，圖2為×1 000時(shí)的酵母細(xì)胞，已經(jīng)形成大量的三葉形合子，可進(jìn)行下一步的篩選。

圖2 雙雜交配子形成檢測(cè)(×1 000)

2.5雙雜交結(jié)果見(jiàn)圖3。雜交的菌液在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/3-AT固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5代后，有2個(gè)菌落仍表現(xiàn)為藍(lán)色，為篩選得到的陽(yáng)性克隆。

圖3 酵母雙雜交篩選結(jié)果

1：陽(yáng)性對(duì)照，Y187(含pGBKT7-53質(zhì)粒)與AH109(含pGADT7-Rec-質(zhì)粒)菌株雜交；2：陰性對(duì)照，Y187(含pGBKT7-Lam質(zhì)粒)與AH109(含pGADT7-Rec-LargeT質(zhì)粒)菌株雜交；3、4：Y187(含pGBKT7-FLA8-C質(zhì)粒)與AH109(文庫(kù)菌)雜交篩選得到的陽(yáng)性克隆。

2.6菌落PCR結(jié)果對(duì)雙雜交篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR，得到大小分別為1 500和1 200 bp的片段。見(jiàn)圖4。

2.7雙雜交測(cè)序結(jié)果及序列分析結(jié)果陽(yáng)性克隆中所含的cDNA片段及所表達(dá)的蛋白經(jīng)測(cè)序鑒定，分別與衣藻、團(tuán)藻、小球藻等生物的預(yù)測(cè)蛋白(含蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和鞭毛相關(guān)蛋白107(FAP 107)同源。杜氏鹽藻預(yù)測(cè)蛋白部分氨基酸序列與衣藻和團(tuán)藻相應(yīng)序列的相似度分別為79%和80%，杜氏鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白部分氨基酸序列與衣藻和團(tuán)藻相應(yīng)序列的相似度均為58%。

圖4 陽(yáng)性克隆菌落PCR結(jié)果

3 討論

在細(xì)胞內(nèi)，大分子蛋白質(zhì)及復(fù)合物需要借助馬達(dá)蛋白將其運(yùn)輸?shù)侥康膮^(qū)域。驅(qū)動(dòng)蛋白是一類馬達(dá)蛋白，利用水解ATP釋放的能量沿著微管移動(dòng)來(lái)運(yùn)輸貨物蛋白[4]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員參與大分子、細(xì)胞器、囊泡的運(yùn)輸，同時(shí)對(duì)有絲分裂、形態(tài)發(fā)育等細(xì)胞活動(dòng)都有重要影響[5-6]。鞭毛/纖毛是細(xì)胞表面突起的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，纖毛異常會(huì)導(dǎo)致多囊腎疾病、肥胖癥、糖尿病及癌癥等人類疾病[7]。驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ是驅(qū)動(dòng)蛋白家族的一個(gè)重要成員，在鞭毛內(nèi)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的作用[8]。鞭毛內(nèi)運(yùn)輸是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的影響[9]，參與鞭毛/纖毛信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[10]。

酵母雙雜交是一個(gè)能夠快速、直接分析體內(nèi)蛋白之間相互作用的方法，可以在一定程度上反映細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。用該方法篩選與驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ動(dòng)力亞單位C端相互作用的蛋白，有助于了解鞭毛內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制及其參與的信號(hào)通路[11]。該實(shí)驗(yàn)中雙雜交篩選得到兩個(gè)和FLA8相互作用的蛋白：FAP107和一個(gè)預(yù)測(cè)蛋白。FAP107是由Pazour等[12]在萊茵衣藻的鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的存在于鞭毛中的未知功能的蛋白質(zhì)，其與FLA8尾部的結(jié)合提示該蛋白可能參與了驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ活性調(diào)控及相關(guān)信號(hào)的傳遞。篩選到的預(yù)測(cè)蛋白所含有的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與多種蛋白質(zhì)的C末端相結(jié)合而參與信號(hào)傳遞[13]，因而該預(yù)測(cè)蛋白與FLA8 C端的結(jié)合很有可能與相關(guān)信號(hào)的傳遞有關(guān)。

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