張瑋 楊風(fēng)琴 廖國玲
作者單位:750004 銀川,寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院
鞭毛是細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)器官,與細(xì)菌致病力密切相關(guān)。通過觀察細(xì)菌菌體有無鞭毛以及鞭毛在菌體的位置和數(shù)量,可鑒定和鑒別細(xì)菌。由于鞭毛非常細(xì)小,在一般光學(xué)顯微鏡下不易觀察其形狀和數(shù)目等,給細(xì)菌分類鑒定和教學(xué)工作帶來諸多不便。此時(shí)需借助特殊染色方法加粗鞭毛,使鞭毛可在光學(xué)顯微鏡下被觀察到[1]。然而鞭毛的染色過程繁瑣、技術(shù)性強(qiáng)、染色步驟較嚴(yán)格,且傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)鞭毛時(shí)間長(zhǎng),初學(xué)者不易掌握。本教研室在過去研究基礎(chǔ)上,經(jīng)反復(fù)實(shí)踐摸索出一種鞭毛改進(jìn)染色法,能在較短時(shí)間內(nèi)獲得較好的染色效果。本文以變形桿菌作為試驗(yàn)對(duì)象,對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)典的魏曦氏鞭毛染液配方、細(xì)菌的培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行探索,現(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 菌種 普通變形桿菌、傷寒桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種,經(jīng)鑒定均符合自身細(xì)菌生物學(xué)特性。
1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂(批號(hào):20170911)、克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基(批號(hào):20180109)和半固體培養(yǎng)基(批號(hào):20180509)均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司;血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號(hào):201902)購自英國OXOID 公司。
1.3 染料及試劑 硫酸鋁鉀(批號(hào):20171011)和鞣酸(批號(hào):20170105)均購自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;石炭酸(批號(hào):20170315)購自天津市化學(xué)試劑三廠;堿性復(fù)紅(批號(hào):20170805)購自上海士鋒生物科技有限公司。
1.4 儀器 壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50A)購自上海博訊有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH6000BII)和數(shù)碼生物顯微鏡(BK5000 Series)均購自重慶奧特有限公司。
1.5 檢測(cè)方法
1.5.1 載玻片處理 將玻片置于肥皂水中煮沸5~10 min,用自來水沖洗后在洗滌液中浸泡0.5~2 h,再用自來水流水沖洗3 h 以上,待干燥后浸于95%乙醇中備用[2]。
1.5.2 改良魏曦氏鞭毛染液配制 A 液:媒染液[3]200 g/L,鞣酸2 mL,飽和硫酸鋁鉀2 mL;B 液:石炭酸復(fù)紅6 mL。在使用前1 周將A 液和B 液按4:6 的比例混合過濾,作為染色應(yīng)用液備用。
1.5.3 菌種培養(yǎng)及制片 將普通變形桿菌和傷寒桿菌于肉湯培養(yǎng)基中復(fù)蘇,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代2 次,再分別接種于半固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂和克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基分別接種3 個(gè),35 ℃分別培養(yǎng)10 h、15 h、20 h。取潔凈玻片置于平臺(tái),將新制蒸餾水滴在玻片上,挑選培養(yǎng)好的菌落或菌苔邊緣部分,在水膜上輕輕接觸一下,使細(xì)菌均勻擴(kuò)散,避免攪動(dòng),以防細(xì)菌鞭毛脫落。自然干燥或置35 ℃溫箱干燥。
1.5.4 鞭毛染色 將制備好的普通變形桿菌和傷寒桿菌涂片置于染色架上,滴加改良鞭毛染色應(yīng)用液染色3~5 min,用蒸餾水緩慢沖洗后晾干鏡檢。菌體和鞭毛均為紅色,若染色時(shí)間長(zhǎng)則鞭毛粗,若染色時(shí)間短則鞭毛細(xì)。
經(jīng)改良鞭毛染色后的菌體完整,易著色,視野清晰,無沉淀顆粒;鞭毛染色以及完整性和伸展性均較好、粗細(xì)適中。
在各培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況:有鞭毛的細(xì)菌數(shù)量較多,無鞭毛脫落。見圖1。
圖1 培養(yǎng)10 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況(油鏡×100)
培養(yǎng)15 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況:60%細(xì)菌有鞭毛。見圖2。
圖2 培養(yǎng)15 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況(油鏡×100)
培養(yǎng)20 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況:20%細(xì)菌有鞭毛,尤其是克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基上有鞭毛的細(xì)菌更少。見圖3。
圖3 培養(yǎng)20 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況(油鏡×100)
魏曦氏鞭毛染色原配方A 液中的石炭酸與堿性復(fù)紅乙醇飽和液相遇可發(fā)生染料沉淀,導(dǎo)致染料有效成分減少,從而影響染色效果。改良染色配方將原配方A 液中的石炭酸去掉,僅用鞣酸和飽和硫酸鋁鉀;將原配方B 液中的堿性復(fù)紅乙醇飽和液換成石炭酸復(fù)紅,避免了上述情況的發(fā)生。經(jīng)改良的A 液與B 液相遇后出現(xiàn)的沉淀減少。另外,原配方中A 液與B 液按1:9 的比例配制,復(fù)紅染料所占比例較大,兩者混合可出現(xiàn)染料沉渣,導(dǎo)致染色背景臟,不利于鞭毛的觀察。而改良染色配方將A 液與B 液按4:6 的比例配制,減少了染料沉渣的出現(xiàn)。
傳統(tǒng)魏曦氏鞭毛染色法需要先將有鞭毛的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)種7 代,對(duì)鞭毛進(jìn)行誘導(dǎo),才能染出滿意的鞭毛[4]。然而經(jīng)過實(shí)驗(yàn)教學(xué)反復(fù)實(shí)踐我們發(fā)現(xiàn),僅需將細(xì)菌復(fù)蘇至第2 代,之后轉(zhuǎn)種于常用的半固體培養(yǎng)基、血瓊脂、營養(yǎng)瓊脂和克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基上,在分離培養(yǎng)鑒定的同時(shí)直接取上述培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色,染色后的鞭毛就已清晰可見,且顏色較深,從而簡(jiǎn)化了操作步驟,節(jié)省了操作時(shí)間。
細(xì)菌鞭毛除了與合適的營養(yǎng)條件和培養(yǎng)溫度有關(guān)外,還與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),大多數(shù)研究報(bào)道的培養(yǎng)時(shí)間為10~24 h[5-6]。本試驗(yàn)設(shè)置了10、15、20 h 3 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段,取各自時(shí)間段的培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色,培養(yǎng)10 h后鞭毛數(shù)量多、粗細(xì)均勻、著色深;15 h 后有鞭毛的細(xì)菌占60%;20 h 后有鞭毛的細(xì)菌僅占20%。由此證實(shí),細(xì)菌鞭毛染色應(yīng)選擇10 h 培養(yǎng)物,此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最旺盛,鞭毛正處于壯年期,鞭毛過長(zhǎng)則菌體趨向衰老,鞭毛脫落則不易觀察到鞭毛[4,7]。
綜上所述,使用改良魏曦氏鞭毛染液配方以及4 種常用培養(yǎng)基的10 h 培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色,鞭毛染色效果好,操作簡(jiǎn)單方便,成功率高,具有較好的使用價(jià)值。