王宗春,郭咸希

(武漢大學人民醫(yī)院藥學部,湖北 武漢 430060)

0 引言

注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣為淡黃色塊狀物或粉末,臨床主要用于心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療,也可用于治療心肌炎、心源性休克、手術(shù)后網(wǎng)膜下出血和銀屑病,并可輔助其他抗癌藥治療白血病.

熱原是引起臨床輸液反應的主要原因,必須嚴格控制靜脈給藥注射液的熱原,中國藥典關(guān)于注射劑控制熱原方法有家兔法和細菌內(nèi)毒素檢查法(鱟試劑法)[1],后者具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡便易行等優(yōu)點,已被各國藥典所采用,目前尚少有該制劑采用鱟試劑法檢查熱原的報道,筆者應用鱟試劑法對注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣進行了研究,為該品種細菌內(nèi)毒素檢測方法的建立提供依據(jù),旨在確保其臨床用藥的安全性.

1 材料與方法

1.1試驗材料注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣4批次(上海第一生化藥業(yè)有限公司,每瓶20 mg,批號分別為1110091、1203102、1205101、1209121);鱟試劑(廈門鱟試劑實驗廠,規(guī)格0.1 mL,批號110124,靈敏度0.5 EU/mL);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司,規(guī)格0.1 mL,批號111207,靈敏度0.5 EU/mL);細菌內(nèi)毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院,每支10 EU,批號2011-07);細菌內(nèi)毒素檢查用水(廈門鱟試劑實驗廠,每支2 mL,批號120307);SW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);微量取液器(50～250 μL)(上海金林生化試劑儀器廠);恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司);細菌內(nèi)毒素檢查用具(湛江安度斯生物有限公司).

1.2細菌內(nèi)毒素備用液的配制將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,在旋渦混合器上混勻15 min,配制成濃度為10 EU/mL的細菌內(nèi)毒素溶液,備用.

1.3鱟試劑靈敏度試驗將上述細菌內(nèi)毒素備用液稀釋成2.00、1.00、0.50、0.25λ4個濃度等級的內(nèi)毒素標準溶液,每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30 s,每一濃度平行做4支,每管加入鱟試劑0.1 mL和內(nèi)毒素標準溶液0.1 mL.同時用細菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對照管,共18管,輕輕混勻后,封閉管口,垂直放入(37±1) ℃恒溫水浴箱中,保溫(60±2) min,將反應管輕輕取出,緩緩倒轉(zhuǎn)180°,觀察結(jié)果,若管內(nèi)形成凝膠,并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性(+);未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性(-).

1.4供試品最大不干擾濃度試驗

1.4.1 預試驗 用細菌內(nèi)毒素檢查用水將注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣溶解,并配制成濃度分別為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的倍比系列溶液(Negative Product Control,NPC),在每一濃度下加入細菌內(nèi)毒素工作標準品溶液,使每一稀釋濃度的供試品溶液中都含有1.0 EU/mL細菌內(nèi)毒素(Positive Product Control,PPC)[2],取上述各溶液0.1 mL加入到已復溶的兩個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(λ為0.5 EU/mL)管內(nèi),每個濃度重復2管,設立陰性對照和陽性對照,按藥典方法進行反應.

1.4.2 確證試驗 根據(jù)預試驗結(jié)果,取濃度為20 mg/mL的供試品溶液及BET水,加入細菌內(nèi)毒素備用液,配制成細菌內(nèi)毒素最終濃度分別為1.000、0.500、0.250 EU/mL的系列溶液,分別取0.1 mL加入到已復溶的兩個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑管內(nèi),每個濃度平行做4管,另取供試品溶液做2支陰性對照管,進行供試品溶液(濃度為20 mg/mL)干擾確證試驗[3-5].

2 結(jié)果與分析

2.1鱟試劑靈敏度試驗結(jié)果2批鱟試劑的靈敏度試驗結(jié)果顯示,最大濃度2λ管均為陽性,最低濃度0.5λ管均為陰性,陰性對照管為陰性,廈門鱟試劑實驗廠生產(chǎn)的鱟試劑(批號110124)靈敏度測定值λc=0.42,湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑(批號111207)靈敏度測定值λc=0.50,均在0.5λ～2.0λ之間,說明2批鱟試劑其靈敏度均符合要求,可用于細菌內(nèi)毒素的檢查.

2.2 供試品最大不干擾濃度

2.2.1 干擾預試驗結(jié)果 表1為干擾預試驗結(jié)果,顯示當濃度為80 mg/mL時,4個批號的供試品均對鱟試劑的凝集反應有抑制作用,濃度為40 mg/mL時部分批號的供試品對凝集反應有抑制作用,而當濃度等于或低于20 mg/mL時抑制作用消失,可以初步判斷供試品最大不干擾濃度為20 mg/mL.

2.2.2 干擾確證試驗結(jié)果 根據(jù)干擾預試驗結(jié)果,選擇濃度為20 mg/mL的供試品溶液進行干擾確證試驗,結(jié)果見表2、3.Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值,Es為用細菌內(nèi)毒素檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值,結(jié)果顯示Et/Es在0.5～2.0之間,按照中國藥典判斷標準,濃度為20 mg/mL的供試品溶液對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間凝集反應既無抑制作用,也無增強現(xiàn)象,說明供試品最大不干擾濃度為20 mg/mL.

表1 供試品干擾預試驗結(jié)果

“+”表示反應呈陽性;“-”表示反應呈陰性(下同).

表2 供試品(20 mg/mL)干擾確證試驗結(jié)果(鱟試劑批號110124)

表3 供試品(20 mg/mL)干擾確證試驗結(jié)果(鱟試劑批號111207)

2.3 注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣細菌內(nèi)毒素檢查法的確定

2.3.1 細菌內(nèi)毒素限值(L)的計算L=K/(M·f)[6],M為人用最大供試品劑量,按照注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣說明書,成人1次最大劑量為2支(40 mg),溶解于5%葡萄糖注射液,靜脈滴注,M=40÷(60×1)=0.667 mg·kg-1·h-1(人均體重按60 kg計算,滴注時間以1 h計);式中K為人每千克體重每小時最大可接受的細菌內(nèi)毒素劑量,中國藥典規(guī)定注射劑K=5 EU·kg-1·h-1;f為安全系數(shù),由于本品主要用于心絞痛、急性心肌梗死等疾病的治療,同時考慮到葡萄糖注射液也含有細菌內(nèi)毒素,為了嚴格控制熱原,將安全系數(shù)f定為3.0,則本品的細菌內(nèi)毒素限值L=5.0/(0.667×3.0)=2.5 EU/mg.

2.3.2 供試品有效稀釋濃度(C) 供試品有效稀釋濃度C=λ/L,L為細菌內(nèi)毒素限值(2.5 EU/mg),λ為鱟試劑靈敏度(0.5 EU/mL)時,對應的C為0.2 mg/mL.

2.3.3 供試品細菌內(nèi)毒素檢查法 由于供試品有效稀釋濃度C為0.2 mg/mL,遠小于該品的最大不干擾濃度(20 mg/mL),當某一濃度的供試品對凝集反應不存在干擾作用時,比該濃度低的供試品也一定不存在干擾作用[6],因此可以將供試品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至濃度為0.2 mg/mL,依中國藥典2010年版(二部)附錄細菌內(nèi)毒素檢查法檢查,細菌內(nèi)毒素限值定為2.5 EU/mg.

3 討論

鱟試劑是目前國際上公認的細菌內(nèi)毒素檢測用試劑,可用于放射性、生物制品、化學藥及中藥等藥物的滅菌制劑細菌內(nèi)毒素檢測,但由于很多藥品對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間的凝集反應具有抑制或增強的干擾作用,出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象,限制了鱟試劑的應用,只有證實供試品在有效稀釋濃度范圍內(nèi)對凝集反應無干擾,鱟試劑方法的結(jié)果方能有效可信.本研究的干擾預試驗顯示,高濃度(80 mg/mL)的二丁酰環(huán)磷腺苷鈣溶液會抑制鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間的凝集反應,但通過稀釋至濃度為20 mg/mL時干擾作用消失,并通過干擾確證試驗得到驗證,即該品的最大不干擾濃度為20 mg/mL.

按照中國藥典2010年版(二部)附錄計算得到注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的細菌內(nèi)毒素限值為2.5 EU/mg,當使用靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑時,對應的供試品有效稀釋濃度為0.2 mg/mL,低于最大不干擾濃度(20 mg/mL),因此使用鱟試劑法檢測該品的細菌內(nèi)毒素是可行的.

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版二部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99-101.

[2] 王宗春,張洪,姜俊勇.鱟試劑方法檢測胎盤多肽注射液中細菌內(nèi)毒素[J].湖北大學學報:自然科學版,2011,33(2):190-192.

[3] 蔡彤,張國來,李波,等.84種注射用藥品細菌內(nèi)毒素檢查法的方法學研究[J].中國藥學雜志,2010,45(2):150-155.

[4] 潘衛(wèi)松,肖瑛,潘建明.熒光素鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國藥房,2009,20(13):1010-1012.

[5] 李浩,李健和,葉清.尼扎替丁氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥業(yè),2009,18(4):38-39.

[6] 黃清泉,夏振民.藥品細菌內(nèi)毒素檢查的實驗設計[J].中國藥學雜志,1997,32(2):72-74.