余 強(qiáng) 劉 洪 楊文萍 李 群 傅 睿

過敏性紫癜(HSP)是兒童時(shí)期最為常見的系統(tǒng)性小血管炎綜合征，臨床表現(xiàn)上除有典型非血小板減少性紫癜樣皮疹外，還可出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫痛、腹痛、消化道出血和血尿，甚至蛋白尿等癥狀。由于HSP相關(guān)病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確，致使在日常臨床診治中缺乏明確的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)。尤其是以腹痛為首發(fā)癥狀的腹型HSP，常被誤診為急腹癥等消化道疾病，從而延誤病情。雖然目前歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟會(huì)議已將病理所見皮膚或腎小球基底膜上IgA類免疫復(fù)合物沉積作為HSP主要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一［1］。但亦有研究提示，HSP的臨床表現(xiàn)類型與皮損處IgAl的沉積強(qiáng)度無明顯相關(guān)［2］，而腹型HSP患兒胃黏膜組織中IgA類免疫復(fù)合物的表達(dá)目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文對腹型HSP患兒胃黏膜IgA、IgA1和肝細(xì)胞生長因子(HGF)表達(dá)情況進(jìn)行分析，初步探討腹型HSP胃組織損傷的發(fā)病機(jī)制，為腹型HSP的早期診斷提供依據(jù)。

1 方法

1.1 腹型HSP診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合2005年歐洲風(fēng)濕病防治委員會(huì)、歐洲兒童腎臟病防治委員會(huì)和美國風(fēng)濕協(xié)會(huì)共同制訂的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］:有持續(xù)或反復(fù)腹痛伴或不伴消化道出血，無典型紫癜樣皮疹且臨床不支持外科疾病。

1.2 分組及其納入條件 ①腹型HSP組:a.2010年9月至2012年11月江西省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科收治通過胃鏡檢查診斷為腹型HSP的患兒;b.臨床診斷HSP前行胃鏡檢查并獲得胃黏膜組織;c.無其他合并癥，且無長期服用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等病史。②非HSP胃炎組:臨床以腹痛或消化道出血為主要表現(xiàn)，胃鏡檢查胃黏膜下未見類似皮膚紫癜樣點(diǎn)片狀隆起、且胃黏膜病理提示炎性改變，并獲取胃黏膜組織的患兒。③正常對照組:取胃腫瘤切除部分胃的遠(yuǎn)離腫瘤部分、并經(jīng)病理證實(shí)為正常的胃黏膜組織的患兒。

1.3 胃黏膜組織IgA、IgA1、HGF表達(dá)水平的測定 各組胃黏膜組織石蠟標(biāo)本切至2～3μm厚度。兔抗人IgA多克隆抗體購自北京中杉金橋公司(批號za-0446)，按1∶30稀釋;鼠抗人IgA1單克隆抗體購自美國Southern Biotech公司(批號9130-0)，按1∶500稀釋;鼠抗人HGF單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(批號BA0911)，按1∶100稀釋。PV-9000二步法試劑盒、AEC顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，牛血清清蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司。胃黏膜組織中IgA蛋白表達(dá)采用免疫組化非生物素二步法檢測，操作步驟按抗體說明書進(jìn)行。

1.4 免疫組化結(jié)果半定量分析 應(yīng)用Nikon顯微鏡行免疫組化結(jié)果觀察，通過Image Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件，計(jì)算胃黏膜IgA、IgA1和HGF染色的強(qiáng)弱。每個(gè)病例于400倍視野下任意選取5個(gè)視野，每個(gè)視野的免疫分?jǐn)?shù)等于陽性染色的平均光密度(IOD)值/(視野面積-空白面積)，每個(gè)病例的免疫分?jǐn)?shù)取5個(gè)視野免疫分?jǐn)?shù)的平均值，即組織中蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組資料間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。按α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，(P＜0.05)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 腹型HSP組納入20例，男13例，女7例，發(fā)病年齡5～13歲，平均年齡(8.3±2.5)歲。非HSP胃炎組納入10例，男6例，女4例，發(fā)病年齡6～11歲，平均年齡(8.9±1.3)歲;正常對照組納入4例，男2例，女2例，發(fā)病年齡4～10歲，平均年齡(7.3±1.9)歲。

2.2 各組胃黏膜組織中IgA、IgA1蛋白的表達(dá) 腹型HSP組胃黏膜組織中均可觀察到IgA、IgA1的表達(dá)(圖1A，B)，主要分布在胃黏膜上皮的表面黏液細(xì)胞內(nèi)和固有層管狀腺之間的間質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞內(nèi)，表1顯示，IgA與IgA1免疫分?jǐn)?shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＞0.05))。非HSP胃炎組胃黏膜組織黏膜上皮及管狀腺之間亦可見IgA、IgA1沉積，但陽性染色弱于腹型HSP組(圖1C，D)，且IgA、IgA1免疫分?jǐn)?shù)及IgA1/IgA的比值低于腹型HSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.01))，非HSP胃炎組IgA、IgA1間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.01))。正常對照組胃黏膜組織未見IgA及IgA1的明顯沉積(圖1E，F(xiàn))，HSP組與非HSP胃炎組IgA、IgA1免疫分?jǐn)?shù)均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.01))。

表1 各組患兒胃黏膜組織IgA、IgA 1和HGF蛋白表達(dá)±s)Tab 1The expressions of IgA，IgA 1 and HGF of gastric mucosa indifferent groups ± s)

表1 各組患兒胃黏膜組織IgA、IgA 1和HGF蛋白表達(dá)±s)Tab 1The expressions of IgA，IgA 1 and HGF of gastric mucosa indifferent groups ± s)

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2.3 各組胃黏膜組織HGF蛋白的表達(dá) 腹型HSP組胃黏膜組織中可觀察到HGF的顯著表達(dá)(圖1G)，主要分布在胃黏膜管狀腺細(xì)胞內(nèi)。非HSP胃炎組胃黏膜組織也可見HGF沉積于管狀腺細(xì)胞內(nèi)，但陽性染色較腹型HSP組偏弱(圖1H)，表1顯示，HGF免疫分?jǐn)?shù)低于腹型HSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.01))。正常對照組胃黏膜組織中HGF無明顯表達(dá)(圖1I)，HGF免疫分?jǐn)?shù)較非HSP胃炎組和腹部HSP組顯著降低((P＜0.01))。

2.4 IgA1與HGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 腹型HSP組胃黏膜組織中IgA1與HGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.892，(P＜0.01))。非HSP胃炎組中IgA1與HGF表達(dá)亦存在正相關(guān)(r=0.634，(P＜0.01))，但正常對照組中兩者表達(dá)無顯著相關(guān)性(r=0.128，P ＞0.05)。

3 討論

近年來，HSP不典型病例逐年增多，臨床上以腹痛、嘔血和便血等非特異性消化道癥狀為首發(fā)表現(xiàn)而就診的患兒不少見。在缺乏紫癜樣皮疹的情況下，腹型HSP患兒常被誤診為急性胃腸炎、消化性潰瘍、急腹癥和腸梗阻等消化道疾病，有部分患兒進(jìn)行剖腹探查仍找不到病因，典型皮疹出現(xiàn)后方能確診，從而耽誤病情，延誤治療。由于HSP的治療與其他常見的消化道疾病截然不同，尤其是HSP合并消化道出血時(shí)往往需要給予大劑量腎上腺皮質(zhì)激素沖擊治療才能使癥狀得以緩解。同時(shí)在對HSP回顧性研究中發(fā)現(xiàn)［4］，腹痛、胃腸道出血與腎臟損傷的發(fā)生有著密切關(guān)系，所以對有腹痛、甚至消化道出血癥狀的腹型HSP患兒，早診斷和早治療就顯得格外重要。

腹型HSP患兒胃黏膜組織內(nèi)除了存在不同程度的充血和水腫外，還可以觀察到部分黏膜下有類似皮膚紫癜樣的點(diǎn)片狀隆起，此為HSP胃鏡下最具特征性的表現(xiàn)，臨床中常以此作為腹型HSP的確診標(biāo)準(zhǔn)。但該法缺乏客觀的病理學(xué)指標(biāo)支持，受胃鏡操作者技術(shù)水平、臨床經(jīng)驗(yàn)等主觀因素影響較大，且部分皮疹遲發(fā)病例，即使在胃鏡觀察下仍無特異性表現(xiàn)，而組織病理檢查只能于光鏡下觀察到固有層水腫、充血、結(jié)締組織增生和血管周圍炎癥等一般消化道疾病均能表現(xiàn)的非特異性改變，導(dǎo)致腹型HSP診斷仍有很大的困難。Alina等［5］對22例HSP患兒行皮膚活檢，發(fā)現(xiàn)皮膚血管壁均可觀察到IgA沉積，部分病例伴有C3、纖維蛋白、IgM和CD3的表達(dá)，據(jù)此提出對皮疹不典型而無其他臨床表現(xiàn)(關(guān)節(jié)炎、腹痛、腎臟受累等)的患兒，可行皮疹部位的皮膚活檢以協(xié)助臨床對HSP的診斷。這也提示對于以腹痛為主要臨床表現(xiàn)而皮疹遲發(fā)的HSP患兒，是否能在進(jìn)行電子胃鏡檢查排除其他消化道疾病的同時(shí)，通過對胃黏膜中某些細(xì)胞因子表達(dá)水平的檢測為腹型HSP的早期診斷提供客觀的依據(jù)呢?

IgA1是免疫球蛋白IgA的一種亞類［6］。異常糖基化的IgA1因糖鏈上唾液酸和(或)半乳糖減少，導(dǎo)致自身空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其不能被正常的代謝途徑所清除，最終在循環(huán)中積聚［7～9］。目前研究顯示［10］，HSP 患兒循環(huán)中的免疫復(fù)合物IgA均為糖基化缺陷的IgA1分子，提示IgA1的異常糖基化可能參與了HSP病程中臟器的損傷。也有研究顯示HSP患兒的胃腸道損傷可能是由IgA介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)引起［11，12］。本研究通過免疫組化法觀察到在腹型HSP患兒胃黏膜中，IgA、IgA1顯著表達(dá)于黏膜上皮的表面黏液細(xì)胞及固有層管狀腺間的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，提示兩者參與了腹型HSP胃黏膜的損傷。

HGF在機(jī)體內(nèi)，尤其是受損組織中作為抗損害因子，起到抗炎、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)受損組織修復(fù)等保護(hù)作用［13］。本研究顯示，HGF在腹型HSP患兒胃黏膜管狀腺細(xì)胞內(nèi)大量沉積，并與胃黏膜中IgA1的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在HSP胃黏膜損傷中可能存在相互作用。提示在發(fā)病初期當(dāng)異常糖基化的IgA1沉積于HSP患兒的胃黏膜組織后，可通過釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子刺激HGF高表達(dá)［14］。雖然在非HSP胃炎組亦可見到IgA、IgA1及HGF的表達(dá)，但程度較腹型HSP組輕，且IgA1/IgA免疫組化分?jǐn)?shù)比值顯著低于腹型HSP組，提示非HSP的胃炎患兒可能在某些因素(如病原體或者炎癥因子等)的刺激下釋放IgA(包括IgA1及IgA2)參與免疫炎癥反應(yīng)，但I(xiàn)gA1可能并不是其主要的介導(dǎo)因子。同時(shí)顯示非HSP胃炎組IgA1與HGF的表達(dá)亦成正相關(guān)，提示僅微量表達(dá)的IgA1仍可通過釋放炎癥因子刺激HGF高表達(dá)。

本文為IgA、IgA1和HGF對腹型HSP患兒診斷的初步研究，鑒于樣本量較小，尚無法計(jì)算各指標(biāo)對于HSP的診斷參數(shù)，但本文結(jié)果顯示這3個(gè)指標(biāo)對于腹型HSP有較好的提示作用，因此有待繼續(xù)收集病例深入分析。

本研究提示，對于臨床表現(xiàn)以腹痛或消化道出血為首發(fā)癥狀、無典型紫癜樣皮疹且臨床不支持外科疾病的患兒，可早期行電子胃鏡檢查，對于胃黏膜下觀察到類似皮膚紫癜樣隆起、尤其是胃黏膜紫癜不典型的患兒，可以通過對其胃黏膜組織IgA1、HGF蛋白表達(dá)進(jìn)行測定，并輔助形態(tài)學(xué)檢查，為臨床早期、準(zhǔn)確的診斷腹型HSP提供一種客觀的依據(jù)。

［1］Ozen S，Pistorio A，Iusan SM，et al. EULAＲ/PＲINTO/PＲES riteria for Henoch-Schonlein purpura，childhood polyarteritis nodosa，childhood Wegene. Granulomatosis and childhood Takayasu arteritis: Ankara 2008. PartⅡ: Final classificationcriteria. Ann Ｒheum Dis，2010，69( 5) : 798-806

［2］Zhang Q(張琴)， Lu L， Lin D.兒童過敏性紫癜血清 IgA1和皮膚小血管IgA1的沉積及意義.Chin J Dermatol(中華皮膚科雜志)，2008，41(1):55-56

［3］Ozen S，Ruperto N，Dillon MJ，et al.EULAR/PReS endorsed consensus criteria for the classification of childhood vasculitides.Ann Rheum Dis，2006，65(7):936-941

［4］de Almeida JL，Campos LM，Paim LB，et al.Renal involvement in Henoch-Schonlein purpura:A multivariate analysis of initial prognostic factors.J Pediatr(Rio J)，2007，83(3):259-266

［5］Murqu A，Mihaila D，Cozma L，et al.Indications and limitations of histopat hological of Henoch-Schonlein purpura in children.Rom J Morphol Embryol，2012，53(3):769-773

［6］Tarelli E，Smith AC，Hendry BM，et al. Human serum IgA1 is substituted with up to six O-glycans as shown by matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight massspectrometry. Carbohydr Ｒes，2004，339( 13) : 2329-2335

［7］ Nartia I，Gejyo F. Pahogenetic significance of aberrantglycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Clin Exp Nephrol，2008，12( 5) : 332-338

［8］Inoue T，Suqiyama H，Kitaqawa M，et al. Abnormalities of glycogenes in tonsillar lymphocytes in IgA nephropathy. Adv Otorhinolarynqol，2011，72: 71-74

［9］Gharavi AG，Moldoveanu Z，Wyatt ＲJ，et al. Aberrant IgA1 glycosylation is inherited in familial and sporadic IgA nephropathy. J Am Soc Nephrol，2008，19( 5) : 1008-1014

［10］Kiryluk K， Moldoveanu Z， Sanders JT. et al. Aberrant glycosylation of IgA1 is inherited in both pediatric IgA nephropathy and Henoch-Schonlein purpura nephritis. Kidney Int，2011，80( 1) : 79-87

［11］李春艷.食物特異性IgG抗體檢測在兒童相關(guān)性疾病中的臨床意義.吉林大學(xué)碩士論文，2008

［12］Kawasaki Y，Hosoya M，Suzuki H，et al.Possible pathologenic role of interleukin-5 and eosino cationic protein in Henoch-Schonlein purpura nephritis.Pediatr Int，2005，47(5):512-517

［13］Boros P，Miller CM.Hepatocyte growth factor:a multi functional cytokine.Lancet，1995，345(8945):293-295

［14］Chan LY，Leung JC，Tsang AW，et al. Activation of tubular epithelial cells by mesangial-derived TNF-alpha:Glomerulotubular communication in IgA nephropathy. KidneyInt，2005，67( 2) : 602-612