郭 霞，楊海燕，張雪娥，吳慧珍，張 琴

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331)

杏鮑菇 (Pleurotus eryngii)學(xué)名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、無隔擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬 (Pleurotus)[1]。杏鮑菇是近年來引進(jìn)開發(fā)的一種優(yōu)質(zhì)食用菌，在全國各地均有栽培，其菌蓋肥厚，菌柄粗大而中實(shí)，質(zhì)地脆嫩細(xì)膩，具有杏仁香味，又有鮑魚口感，有“草原上的美味牛肝菌”、“平菇王”的美譽(yù)。此外，杏鮑菇子實(shí)體蛋白質(zhì)含量較高，脂肪和總糖含量較低，富含礦物質(zhì)和維生素，具有抗癌、抑制腫瘤和美容的功效，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景[2，3]。

目前，由液體發(fā)酵法生產(chǎn)菌絲體及胞外產(chǎn)物的方法，具有發(fā)酵周期短、容易操作、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到研究者的關(guān)注。研究適宜杏鮑菇菌絲生長的培養(yǎng)基，不僅可以為工業(yè)化生產(chǎn)菌絲及胞內(nèi)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)，還有利于人工栽培縮短菌絲生長時(shí)間，從而提高生產(chǎn)效率。因此，探索一種有利于杏鮑菇菌絲體生長的培養(yǎng)基非常必要。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試杏鮑菇菌株由組織分離獲得，子實(shí)體購于重慶盤溪市場，由重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究所研究人員鑒定保存。

1.2 種子液的制備

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯 200.0 g·L－1、葡萄糖 11.0 g·L－1、蛋白胨 2.0 g·L－1、KH2PO43.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL。從活化的 PDA培養(yǎng)菌種上取3塊0.5 cm2的菌塊，接入搖瓶中，溫度 (27±0.5)℃，180 r·min－1培養(yǎng) 168 h，制得液體種子液[4]。

1.3 測定方法

1.3.1 菌絲生物量的測定

將發(fā)酵液真空抽濾，用蒸餾水清洗干凈后，收集菌絲體，(60±0.5)℃下烘干至恒重，電子天平稱重。

1.3.2 油的測量

取5.0 mL發(fā)酵液，按照1∶2的體積加入乙醚，添加到分液漏斗中震蕩，分層后去掉下層，上清液放入稱量杯中，(60±0.5)℃烘干稱重。

1.4 碳源對菌絲生長的影響

1.4.1 糖種類篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖 20.0 g·L－1、蛋白胨 5.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、KH2PO40.5 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL，pH 6.0。

分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照，每個(gè)配方做3個(gè)重復(fù)。接種量5.0%，每250 mL裝液100 mL，培養(yǎng)溫度(27 ±0.5)℃、轉(zhuǎn)速180 r·min－1，震蕩培養(yǎng)168 h。

1.4.2 植物油篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10.0 g·L－1芝麻油、花椒油、蔥油、大豆油、辣椒油、菜籽油、瓜子油[5]，培養(yǎng)方法同1.4.1。

1.5 氮源對菌絲生長的影響

分別用硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、麥麩代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照，培養(yǎng)方法同1.4.1。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取可溶性淀粉、牛肉膏、蔥油做三因素三水平的正交設(shè)計(jì)，共9個(gè)組合 (表1)。

1.7 發(fā)酵過程分析

利用搖瓶實(shí)驗(yàn)比較了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后和優(yōu)化前發(fā)酵液在0～168 h的生物量、pH和殘油量變化，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)因子水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因子水平表L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌絲生長的影響

2.1.1 碳源對菌絲生長的影響

碳源對菌絲生物量的影響見表2。

表2 碳源對菌絲生物量的影響

由表2可見杏鮑菇對可溶性淀粉利用較好，菌絲干重達(dá)到(18.516±1.959)g·L－1，其次是葡萄糖，菌絲干重達(dá)到(12.812±0.231)g·L－1。蔗糖、麥芽糖、甘油、乳糖分別為碳源時(shí)，菌絲干重分別達(dá)到 (11.732±0.72)g·L－1、(11.315±0.603)g·L－1、(11.211 ±0.217)g·L－1、(9.016 ±0.048)g·L－1。通過單因素方差分析，杏鮑菇菌絲體以可溶淀粉為碳源時(shí)，能顯著提高菌絲產(chǎn)量 (p＜0.05)。以乳糖為碳源時(shí)，生物量顯著降低。因此，選擇可溶性淀粉進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 植物油對菌絲生長的影響

通過單因素方差分析，結(jié)果見表3。

表3 不同植物油對菌絲生物量的影響

從表3可知植物油能顯著提高菌絲產(chǎn)量 (p＜0.05)。其中，添加蔥油后菌絲生物量最大，達(dá) (35.467±0.091)g·L－1，其次是辣椒油、瓜子油、大豆油、花椒油、芝麻油、菜籽油。

2.2 氮源對菌絲生長的影響

氮源對菌絲生物量的影響見表4。

表4 不同氮源對菌絲生物量的影響

由表4可知，有機(jī)氮源更適宜菌絲生長，牛肉膏為氮源時(shí)可獲得最大生物量 (19.056±0.241)g·L－1，生物量顯著提高 (p＜0.05)，其次是蛋白胨和酵母膏。硫酸銨或硝酸銨為唯一氮源時(shí)，菌絲產(chǎn)量顯著下降。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果、方差分析結(jié)果見表5、表6。

表5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表6 方差分析

通過正交試驗(yàn)的極差分析及方差分析，表5中極差R為同一因素中各水平的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)總和的最大與最小值之差，其大小表示各因素水平的變化對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響。各因素的影響依次為蔥油＞牛肉膏＞可溶性淀粉，與表6中方差分析結(jié)果一致。方差分析結(jié)果顯示，蔥油和牛肉膏濃度對生物量具有顯著影響 (p＜0.05)，可溶性淀粉濃度對生物量的影響未達(dá)到顯著水平。因此，從節(jié)約成本出發(fā)，最優(yōu)組合為A1B3C3即7 號培養(yǎng)基，淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、蔥油15.0 mL·L－1，可獲得最大生物量 35.672 g·L－1。

2.5 發(fā)酵過程分析

杏鮑菇菌絲發(fā)酵過程分析見圖1。

通過圖1發(fā)酵過程曲線分析，優(yōu)化前生物量明顯比優(yōu)化后生物量低，可見培養(yǎng)基優(yōu)化后生物量明顯提高。在0～96 h蔥油迅速被菌絲利用完，在120 h菌絲生物量達(dá)到最大(35.810±3.232)g·L－1，而對照在 168 h才達(dá)到最大生物量 (17.223±0.401)g·L－1。優(yōu)化后的發(fā)酵液pH從24 h～120 h迅速降低，120 h時(shí)pH降到最低5.0，120 h后逐漸升高，而對照組在0～168 h呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基中菌絲代謝更旺盛，產(chǎn)生了大量酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH降低。

3 討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，不同營養(yǎng)物質(zhì)對菌絲生長有顯著影響。蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖、葡萄糖分別為碳源時(shí)，可溶性淀粉為最適碳源;植物油能顯著促進(jìn)菌絲生長，在辣椒油、瓜子油、大豆油、蔥油、花椒油、芝麻油、菜籽油中，添加10.0 g·L－1蔥油后，菌絲生物量最大。Wardle[6]等也發(fā)現(xiàn)將類脂加到香菇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，促進(jìn)了蘑菇菌絲體生長。趙明亮[7]等通過香菇液體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)油能促進(jìn)香菇菌絲生長。Yang[8]等在灰樹花深層培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)每100毫升0.15 g油酸能促進(jìn)菌絲生長，棕櫚酸也能促進(jìn)多糖合成，但是每100毫升0.1 g亞油酸能顯著抑制菌絲和多糖的合成。鄒祥等[5]在藥用真菌桑黃的液體發(fā)酵中也發(fā)現(xiàn)菜籽油能提高桑黃菌絲的生物量，但是對胞外多糖具有顯著抑制作用，其機(jī)理可能是植物油促進(jìn)了細(xì)胞膜的通透性，有利于菌絲對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的吸收，從而促進(jìn)菌絲生長。有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于杏鮑菇菌絲生長，硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨中，牛肉膏為最適氮源。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化菌絲生長培養(yǎng)基，最優(yōu)組合為淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、蔥油 150.0 g·L－1，菌體生物量可達(dá) 35.672 g·L－1。其中，蔥油和牛肉膏濃度是提高產(chǎn)量的重要因素。根據(jù)發(fā)酵過程分析，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)菌絲生長代謝，提高了菌絲生物量，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基確實(shí)更適合菌絲生長。

雖然對杏鮑菇工業(yè)化人工栽培的報(bào)道較多，但是通過液體培養(yǎng)獲得大量菌絲體的報(bào)道較少，尤其是在添加植物油能顯著提高生物量、縮短菌絲生長時(shí)間方面還未見文獻(xiàn)報(bào)道。在優(yōu)化的培養(yǎng)基下菌絲生物量明顯增加，其菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)菌絲多糖含量及結(jié)構(gòu)變化等研究工作正在進(jìn)行中，希望能對杏鮑菇人工栽培，提高菌絲及胞內(nèi)產(chǎn)物產(chǎn)量提供理論參考。

[1]金周雨，李艷麗，王雪.杏鮑菇菌絲體水溶性多糖提取及培養(yǎng)條件優(yōu)化 [J].菌物研究，2009，7(2):57－61.

[2]王鳳芳.杏鮑菇中營養(yǎng)成分的分析測定 [J].食品科學(xué)，2002，23(4):132－135.

[3]潘崇環(huán)，孫萍.珍稀食用菌栽培與名貴野生菌的開發(fā)利用 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[4]何莉莉，韓成玲，范文麗，等.礦質(zhì)元素對北蟲草繼代培養(yǎng)不同菌落子實(shí)體產(chǎn)量及菌絲生長速度的影響[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(9):1331－1340.

[5]鄒祥，郭霞，孫敏.前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響[J].食品科學(xué)，2010，31(21):262－265.

[6]張郁松，蠶蛹油超臨界萃取與有機(jī)溶劑萃取的比較研究[J].糧油加工，2009(2):45－46.

[7]趙明亮，鄧世瑜.油與香菇菌絲生長的關(guān)系 [J].食用菌，1987(26):19－20.

[8]Yang FC，Ke YF，Kuo SS.Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask culture[J].Enzyme and Microbialogy Technology，2000(27):295－301.