張麗平，蔣 旎，余曉琴

(1.成都紡織高等專科學(xué)校染化系，四川 成都 611731;2.四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川 成都 610097)

松茸、又名松蕈，被譽(yù)為“食用菌之王”，營養(yǎng)豐富，含多種氨基酸和維生素，同時(shí)具有防輻射、降血脂、增強(qiáng)免疫等功效[1]。松茸具有的生理功能與其含有多種抗氧化活性物質(zhì)有一定的相關(guān)性。

目前，雖然有多種生物的、化學(xué)的鑒別天然抗氧化劑的抗氧化活性的方法，但大多數(shù)方法都是從一個(gè)角度來評價(jià)天然抗氧化物在食品和生物體體系中的多功能作用。合理有效的評價(jià)抗氧化活性的方案，需要幾種建立在不同作用機(jī)理上的方法來進(jìn)行抗氧化評價(jià)[2]。

超臨界流體萃取是一種殘留小、污染少的新型分離提取技術(shù)，被廣泛用于真菌活性成分的提取和制備[3－5]，但松茸超臨界CO2萃取還鮮有報(bào)道。本文擬采取超臨界CO2萃取技術(shù)提取松茸中的抗氧化成分，并從抗脂質(zhì)氧化和自由基清除兩方面研究該提取物的抗氧化活性，為松茸的有效利用提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

新鮮松茸，購自四川東億食品有限公司，產(chǎn)自云南省松茸野生基地，原料要求色澤純正、無損傷的新鮮樣品，除泥后待用;2，2－二苯基苦基苯肼 (DPPH)，美國Sigma－aldrich公司;蘆丁色譜純，中國生物制品檢定所;β－胡蘿卜素、亞油酸，美國NU－CHEK公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

0.5 L超臨界CO2萃取儀，四川德陽四創(chuàng)科技有限公司;UV－2000型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司;RE－2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UFREEZE DRYIN G－03型凍干試驗(yàn)機(jī)，廈門聯(lián)友冷凍設(shè)備有限公司;A－2004型電子分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料預(yù)處理

新鮮松茸經(jīng)冷凍干燥后粉碎過篩放置于干燥器中待用[6]。

2.2 松茸超臨界CO2萃取物的制備

準(zhǔn)確稱取松茸粉末250 g，裝入0.5 L萃取釜中。對萃取釜、分離釜分別進(jìn)行加熱，升到所需溫度后，泵進(jìn)CO2氣體，當(dāng)萃取釜壓力升高到一定壓力后，調(diào)節(jié)進(jìn)氣量，保持恒溫恒壓進(jìn)行循環(huán)萃取，每隔15 min從分離釜進(jìn)行取料，總萃取時(shí)間1.5 h，超臨界狀態(tài)下的CO2流量為15 L·h－1。以乙醇作為夾帶劑，夾帶劑用量2.0 mL·g－1樣品，壓力30 MPa，溫度65℃。收集超臨界流體萃取物，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。濃縮物用氮?dú)獯祾?，除去殘留的乙醇。濃縮后的樣品置4℃下冷藏備用[3]。

2.3 松茸萃取物抗脂質(zhì)氧化能力

將2.4 mL含有2.6 mmol·L－1亞油酸的β－胡蘿卜素乳化溶液加入到比色管中，于37℃下恒溫放置，同時(shí)做不含亞油酸的空白對照管和加入標(biāo)準(zhǔn)BHT(0.01 mg·mL－1)管。20 min后，待比色皿中的溶液熱平衡后，加入0.5 mol·L－1偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽進(jìn)行油脂的自動(dòng)氧化，15 min后加入不同體積 (0.5 μL單位體積)的松茸超臨界CO2萃取濃縮物，并于470 nm下進(jìn)行比色，通過吸光度的變化來反映萃取物的濃度－反應(yīng)關(guān)系[7，8]。

2.4 松茸萃取物對DPPH自由基的清除能力

將精確配制好的5 mmol·L－1的DPPH溶液1 mL，加入到3 mL 不同濃度 (50 μg·mL－1、100 μg·mL－1、200 μg·mL－1、500 μg·mL－1、1 000 μg·mL－1)的松茸提取物溶液中，混合好后，于室溫下放置30 min后，測定517 nm下吸光度的值，DPPH自由基清除率 (P)公式為[9－11]:

式中:A空白為未加多糖溶液的空白試驗(yàn) (以蒸餾水代替)的吸光度;A樣品為不同濃度反應(yīng)液的吸光度。

同時(shí)測定Vc和蘆丁水溶液的DPPH自由基清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗脂質(zhì)氧化能力

β－胡蘿卜素亞油酸體系在偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽的作用下發(fā)生自動(dòng)氧化，β－胡蘿卜素氧化后會逐漸褪色，褪色的程度反應(yīng)氧化的程度，吸光度會越來越小。添加抗氧化物質(zhì)后會延緩氧化的進(jìn)行，抗氧化能力越強(qiáng)，吸光度下降越慢，與標(biāo)準(zhǔn)的BHT溶液比較可計(jì)算出抗氧化能力的BHT當(dāng)量，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，添加松茸萃取物最初幾分鐘內(nèi)，油脂的氧化抑制并沒有表現(xiàn)出來，隨著松茸萃取物的消耗，抗氧化活性開始表現(xiàn)出來，空白組沒有表現(xiàn)出氧化抑制的現(xiàn)象。

通過實(shí)驗(yàn)測定，發(fā)現(xiàn)每克松茸樣品中所含有的抗氧化活性物質(zhì)相當(dāng)于4 mg的BHT，說明松茸萃取物具有優(yōu)良的抗脂質(zhì)氧化能力。

3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2結(jié)果表明，Vc對DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)，200 μg·mL－1的Vc清除率即可達(dá)到90%以上。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，松茸萃取物對DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而提高，在0.1 mg·mL－1～1 mg·mL－1范圍內(nèi)清除率呈現(xiàn)平穩(wěn)提升的趨勢，最高可達(dá)73%。質(zhì)量濃度在0.2 mg·mL－1～1 mg·mL－1范圍內(nèi)，松茸萃取物的DPPH自由基清除率高于蘆丁對照品。說明松茸的超臨界CO2萃取物有明顯的清除自由基的能力。

4 討論

天然抗氧化物在食品和生物體體系中的作用是多方面的，可能是通過抑制脂肪氧化來起作用，也可能是通過自由基猝滅來達(dá)到抗氧化的效果。本次實(shí)驗(yàn)顯示松茸超臨界CO2萃取物具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，最高可達(dá)73%的清除率，同時(shí)可以有效抑制亞油酸的自動(dòng)氧化。表明松茸的超臨界CO2萃取物具有一定的體外抗氧化作用，這可以為松茸保健品的開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)和參考。

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