野鳶尾總黃酮的提取*

齊建紅，趙詠梅，方剛，李丹，王改改

(西安文理學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，陜西西安，710065)

野鳶尾(Iris dichotoma)為鳶尾科鳶尾屬植物，又名白射干、射干鳶尾，根莖或全草入藥，具有清熱解毒、止痛等功效。廣泛分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、陜西等地，生于沙質(zhì)草地、山坡、丘陵等處［1］。常用于咽喉腫痛、胃痛、肝炎、乳腺炎、牙齦腫痛等治療［2］。迄今為止，從野鳶尾中已經(jīng)分離得到了30多個(gè)化合物［3］，主要為黃酮類(lèi)化合物［4］。黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于植物中，它的生理活性較為廣泛，具有抗氧化抗衰老、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、治療腦血管病及降血脂等功能［5］。本文對(duì)野鳶尾中主要的活性成分——總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，以便更好地開(kāi)發(fā)和利用野鳶尾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野鳶尾(采自陜西秦嶺紅河谷，經(jīng)張九東老師鑒定為野鳶尾)，蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，硝酸鋁，亞硝酸鈉，無(wú)水乙醇等均為分析純。

UV－2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，JY92－2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，F(xiàn)Z102型微型植物試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，萬(wàn)分之一天平(德國(guó)賽多利斯)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密量取0.15 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇5 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)30.3 mL，搖勻，放置6 min;最后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以空白試劑做對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450～550的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取野鳶尾粉末1.0 g于燒杯中。加入一定量60%的乙醇在一定溫度下200 W超聲一定時(shí)間趁熱減壓抽濾得上清液即可。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6］

精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，于小燒杯中，用60%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容，搖勻，即得0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL分別置于10 mL容量瓶中;加入60%乙醇至5 mL;加入5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min。最后加入1 mol/LNaOH溶液2 mL。用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，放置15 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個(gè)試驗(yàn)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，每因素3個(gè)水平(表1)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化野鳶尾總黃酮的提取工藝。

1.2.5 樣品分析

對(duì)正交試驗(yàn)溶液按1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮得率。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

從圖1可以看出，蘆丁在波長(zhǎng)450～504 nm時(shí)吸光度不斷增大，當(dāng)波長(zhǎng)超過(guò)504 nm之后，吸光度呈下降趨勢(shì)，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為504 nm。

圖1 檢測(cè)波長(zhǎng)的掃描Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)測(cè)定不同濃度的蘆丁對(duì)照品溶液吸光度值，以濃度(mg/mL)對(duì)吸光度值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為Y=12.674X+0.0044，R2=0.999 4。結(jié)果表明蘆丁含量在0.0～0.75 mg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖2所示。

圖2 方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Methed－standard curves

2.3 方法學(xué)考察［7］

2.3.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，加60% 乙醇5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對(duì)照品為空白，在504 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)6次，平均吸光度為0.582，計(jì)算得RSD為1.04%，精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1份野鳶尾供試品溶液3 mL，按照1.2.3 項(xiàng)中的方法顯色，分別于間隔0、10、20、30、40、50、60 min，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，1 h內(nèi)吸光度值無(wú)明顯變化，計(jì)算得RSD 1.22%，供試品溶液顯色后在1 h內(nèi)穩(wěn)定。所得總黃酮穩(wěn)定性好，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按照野鳶尾供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液(相同藥材重量)，然后分別按照1.2.3項(xiàng)中的方法顯色進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算野鳶尾總黃酮得率，RSD 1.42%，此方法重復(fù)性良好。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選總黃酮提取工藝

從表2數(shù)據(jù)分析可知，乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、固液比4個(gè)因素對(duì)野鳶尾總黃酮提取的影響主次順序?yàn)?提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間。實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)因素水平組合為A2B2C3D1，即，乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為5 min，提取溫度為90℃，料液比1∶20。野鳶尾總黃酮的得率為4.007 mg/g。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test

2.5 實(shí)驗(yàn)因素對(duì)總黃酮提取量影響的方差分析

從方差分析結(jié)果(見(jiàn)表3)可知，乙醇濃度和提取溫度2個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率都有顯著影響，液料比和提取時(shí)間的影響不顯著。提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響最大，乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率影響較大，其次，料液比對(duì)總黃酮的提取有一定影響，4個(gè)因素中，以提取時(shí)間影響最小。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3 結(jié)論

野鳶尾可以作為觀賞植物，又具有一定的藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)野鳶尾總黃酮進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化研究，結(jié)果表明，影響野鳶尾總黃酮的最佳提取工藝因素為提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間，最佳提取工藝條件為A2B2C3D1。即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比1∶20(g∶mL)，提取時(shí)間為 5 min，提取溫度為90℃，此條件下總黃酮為4.007 mg/g。為野鳶尾中黃酮成分在食品藥品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

［1］趙毓棠.中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1985，16(1):134.

［2］王冰，徐巖，鄭太坤，等.射干鳶尾的核型分析［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33(12):716－719.

［3］齊建紅，翟永功，趙長(zhǎng)琦.鳶尾屬植物的化學(xué)成分及其生物活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18(1):165－170.

［4］齊建紅.野鳶尾植物的生物學(xué)特征及化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，(2):121－123.

［5］曹緯國(guó)，劉志勤，邵云，等.黃酮類(lèi)化合物藥理作用的研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報(bào)2003，23(12):2241－2247.

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