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      麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)*

      2013-11-21 10:01:32于博柏玉香金征宇吳月純湯尚文吳進(jìn)菊
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2013年7期
      關(guān)鍵詞:糖苷鍵普魯蘭糖基

      于博,柏玉香,金征宇,吳月純,湯尚文,吳進(jìn)菊

      1(湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院,湖北襄陽(yáng),441053)2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫,214122)

      β-環(huán)糊精(β-CD)作為一類(lèi)重要的主體化合物,在食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工、分子識(shí)別、化學(xué)分析以及催化反應(yīng)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其獨(dú)特剛性空腔結(jié)構(gòu)能夠包和或部分包和客體分子,從而形成主-客體復(fù)合物,改變客體分子物理化學(xué)或生物學(xué)特性[1]。但β-CD水溶性較差而且其溶血效應(yīng)和非消化道安全性制約著其應(yīng)用范圍[2-4]。為了增加環(huán)糊精的水溶性,降低其對(duì)生理系統(tǒng)的不良影響,化學(xué)或生物改性環(huán)糊精是科學(xué)可行的解決方案。通常利用化學(xué)試劑或生物酶法將特定的分子基團(tuán)接枝到母體環(huán)糊精,一方面可以有效地增加其水溶性,另一方面,側(cè)鏈基團(tuán)的引入會(huì)降低或消除其溶血性和腎毒性。分支環(huán)糊精便是通過(guò)引入糖基來(lái)提高β-CD水溶解度的一種策略,葡萄糖基環(huán)糊精(G-β-CD)[5-6]、麥芽糖基環(huán)糊精(G2-β-CD)[7-12]、半乳糖基環(huán)糊精(Gal-β-CD)[13,14]、甘露糖基環(huán)糊精(Man-β-CD)[15]等已經(jīng)通過(guò)酶法制備得到。

      本課題組利用普魯蘭酶的反向合成特性[16],經(jīng)過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將麥芽三糖基引入到母體環(huán)糊精上獲得了麥芽三糖基-β-環(huán)糊精(G3-β-CD),并對(duì) G3-β-CD進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和鑒定。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      G3-β-CD 是以普魯蘭和 β-環(huán)糊精為底物,應(yīng)用普魯蘭酶水解和反向合成特性制備,并在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化;普魯蘭、β-環(huán)糊精,上海 Sigma-Aldrich公司;普魯蘭酶,杰能科生物工程有限公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

      HPLC-20AT,日本島津公司;NEXUS47傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)Thermo公司;Waters ZMD電噴霧質(zhì)譜儀,美國(guó)Waters公司;AVANCE 400核磁共振儀,德國(guó)Bruker公司;AB135-S型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Delta320 pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的純度分析

      采用氨基柱進(jìn)行分析,檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器,泵為島津 LC-20A;色譜柱為 Lichrospher NH2(5 μm,4.6 mm ×250 mm);乙腈∶水(體積比 70∶30);柱溫選擇35°C;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

      1.3.2 紅外光譜分析方法

      采用KBr壓片法制備分析樣品,干燥樣品與KBr以1∶100的質(zhì)量比進(jìn)行混合研磨,壓片后置于NEXUS47傅里葉變換紅外光譜儀中,進(jìn)行測(cè)試。

      1.3.3 電噴霧質(zhì)譜分析

      采用電噴霧電離質(zhì)譜分析樣品分子質(zhì)量。在Waters ZMD電噴霧電離質(zhì)譜儀上,采用電噴霧式電離,電噴霧電壓為3.7 kV,離子源的溫度為120℃,脫溶溫度為300℃,離子能量選用1.0eV。

      1.3.4 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的酶解分析

      將10 mg G3-β-CD 溶解于 0.5 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(20mmol/L、pH 5.0)中,加入普魯蘭酶,在50℃下孵育30 min,高溫滅活酶后,對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。

      1.3.5 核磁共振分析方法

      將G3-β-CD溶解于重水后,放置于5 mm內(nèi)徑的專(zhuān)用核磁管中,在AVANCE 400核磁共振儀上進(jìn)行的1H NMR,13C NMR和HMBC分析。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的純度分析

      如圖1所示,由本實(shí)驗(yàn)室所制備分離純化得到的G3-β-CD純度很高,根據(jù)HPLC峰面積積分,其純度>99.5%。這表明本課題組所采用的G3-β-CD制備分離方法科學(xué)有效,這為進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

      圖1 G3-β-CD 的 HPLC 圖Fig.1 HPLC of G3-β-CD

      2.2 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的紅外光譜分析

      如圖2所示,紅外光譜曲線(xiàn)從上到下依次是G3-β-CD、β-CD和麥芽三糖(G3)。圖2中3種成分的紅外光譜都顯示了糖類(lèi)的特征吸收峰,3 400 cm-1為O—H的伸縮振動(dòng)峰,2 927 cm-1為C—H伸縮振動(dòng)峰,1 640 cm-1為 O—H 彎曲振動(dòng)峰,1 150 cm-1為 CO振動(dòng)峰,這與糖類(lèi)結(jié)構(gòu)解析文獻(xiàn)中的報(bào)道一致[17]。圖2中845~855 cm-1波長(zhǎng)范圍出現(xiàn)的吸收峰主要是由α-糖苷鍵的特征吸收所引起的,在紅外譜圖中未出現(xiàn)β-糖苷鍵的特征吸收峰,這表明麥芽三糖基是以α型糖苷鍵與β-CD相連。從圖2中還可以看到,β-CD在3 400 cm-1左右的羥基吸收峰的峰形比G3-β-CD的峰形更寬,這主要是由于麥芽三糖基接枝到β-CD,部分地打開(kāi)了環(huán)糊精分子內(nèi)的氫鍵,致使峰形尖銳,而母體環(huán)糊精由于形成的分子內(nèi)氫鍵穩(wěn)定,化學(xué)鍵力常數(shù)小,從而在3 400 cm-1處產(chǎn)生寬而強(qiáng)的吸收。由于分子內(nèi)羥基所形成的氫鍵是阻礙環(huán)糊精分子水合的主要原因,側(cè)鏈基團(tuán)麥芽三糖基的引入部分地破壞了母體環(huán)糊精的分子內(nèi)氫鍵從而減少了分子水合阻礙,這有利于增加G3-β-CD在水中的溶解度。

      圖2 G3-β-CD 的紅外光譜Fig.2 FTIR spectrum of G3-β-CD

      2.3 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的電噴霧質(zhì)譜

      根據(jù)電噴霧電離質(zhì)譜的一般規(guī)律,結(jié)合圖3中[M-H]+和[M]-的 m/z分別為1 619.5和1 621.5,可推斷出麥 G3-β-CD 的分子質(zhì)量為 1 620.5,這與G3-β-CD的理論分子質(zhì)量相一致。

      圖3 G3-β-CD 的電噴霧質(zhì)譜Fig.3 ESIMS spectra of G3-β-CD in the negative and positive mode

      2.4 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的酶解分析

      為了進(jìn)一步確證產(chǎn)品G3-β-CD的結(jié)構(gòu),采用普魯蘭酶水解G3-β-CD,酶解1 h后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè),并與麥芽三糖、β-CD標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖比較,發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的HPLC保留時(shí)間分別為12.359 min、16.212 min,這與麥芽三糖和β-CD標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相一致。這說(shuō)明本課題組所合成的G3-β-CD是由麥芽三糖和β-CD組成,結(jié)合電噴霧質(zhì)譜分析的分子量,可以推斷出G3-β-CD是由一分子麥芽三糖通過(guò)糖苷鍵與一分子β-CD相連接。

      圖4 G3-β-CD 酶解產(chǎn)物的 HPLCFig.4 HPLC of G3-β-CD hydrolyzed with pullulanase

      2.5 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的核磁共振分析

      G3-β-CD 的1H NMR 分析如圖5所示,參照文獻(xiàn)[18-20],對(duì) G3-β-CD 的質(zhì)子化學(xué)位移進(jìn)行歸屬。1H NMR譜中包含3種不同的端基質(zhì)子,分別為環(huán)糊精葡萄糖殘基A1~A7上的H-1(δ 4.95-4.9)、接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1上的的H-1(δ 4.8)和支鏈葡萄糖殘基 B2和 B3對(duì)應(yīng)的 H-1(δ 5.17,δ 5.23),3 種類(lèi)型的端基質(zhì)子強(qiáng)度積分比為7∶1∶2,這說(shuō)明3種不同的葡萄糖殘基摩爾比為7∶1∶2。

      G3-β-CD的13C NMR 分析如圖6所示,參照文獻(xiàn)[18-21],對(duì) G3-β-CD 的碳信號(hào)進(jìn)行歸屬。G3-β-CD的13C NMR譜中包含3種不同的C-1信號(hào),分別為環(huán)糊精葡萄糖殘基 A1~A7的 C-1(δ 103.05-102.76),接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C-1(δ 99.68)和支鏈葡萄糖B2和B3的C-1(δ 101.06-100.87),3種C-1的信號(hào)強(qiáng)度比為7∶1∶2。從13C NMR譜圖發(fā)現(xiàn)了2種C-6信號(hào),一種來(lái)自環(huán)糊精葡萄糖殘基A1~A7和支鏈葡萄糖殘基B2和B3的C-6信號(hào)(δ 61.68-61.25),一種來(lái)自接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C-6信號(hào)(δ 68.20)。由于吡喃糖殘基的C-6信號(hào)通常出現(xiàn)高磁場(chǎng)區(qū)域,δ 68.20出現(xiàn)的C-6信號(hào)明顯地向低場(chǎng)發(fā)生了移動(dòng),這表明麥芽三糖基接枝在葡萄糖殘基B1上。

      圖5 G3-β-CD 的1H 核磁共振圖Fig.5 1H NMR spectrum of G3-β-CD

      圖6 G3-β-CD 的13C 核磁共振圖Fig.6 13C NMR spectrum of G3-β-CD

      G3-β-CD的13C NMR 譜有4種 C-4的信號(hào),分別為環(huán)糊精分子 A1~A7上的 C-4(δ 82.64-82.04),接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C-4(δ 79.18)、支鏈葡萄糖殘基B2的C-4(δ 78.01)和支鏈最遠(yuǎn)端葡萄糖殘基B3的C-4(δ 70.45),葡萄糖殘基B3的C-4由于遠(yuǎn)離環(huán)糊精主環(huán),化學(xué)位移受糖苷鍵影響較小,很大程度保持了其原來(lái)的化學(xué)位移值。

      HMBC譜可以揭示糖單元的連接方式,G3-β-CD的HMBC譜如圖7(a)所示。從圖7(a)中可以看出,環(huán)糊精分子葡萄糖殘基A1~A7的C-4與H-1在δ 82.32,5.06出現(xiàn)了多重耦合峰,C-1與H-4在δ103.02,3.58出現(xiàn)了多重耦合峰,表明產(chǎn)品中C-4與H-1、C-1與H-4相連,這表明環(huán)糊精分子的主環(huán)糖殘基以α-1,4糖苷鍵首尾相連。HMBC譜中接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C-6與環(huán)糊精葡萄糖殘基A7的H-1在 δ 68.20,4.93出現(xiàn)單一耦合峰(圖7(b)),這表明該葡萄糖殘基 B1和A7以 α-1,6糖苷鍵相連。接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C-4與支鏈葡萄糖殘基B2的H-1在δ 79.18,5.32出現(xiàn)單一耦合峰(圖7(c)),這表明葡萄糖殘基 B1和 B2是以 α-1,4糖苷鍵相連。綜合以上分析可以得出結(jié)論G3-β-CD的結(jié)構(gòu)為單取代-6-O-α-D-麥芽三糖基-β-環(huán)糊精(圖8)。

      3 結(jié)論

      經(jīng)過(guò) HPLC鑒定,G3-β-CD 的純度達(dá)到 99%以上,這表明本課題組所設(shè)計(jì)的制備和分離方案科學(xué)有效。通過(guò)電噴霧質(zhì)譜的分析,可計(jì)算出 G3-β-CD的分子質(zhì)量為1 620.5,這與其理論分子質(zhì)量相一致。結(jié)合酶解產(chǎn)物的HPLC分析和紅外光譜,可知產(chǎn)物有一分子的麥芽三糖通過(guò)α型糖苷鍵與β-CD連接而成,紅外譜圖中麥芽三糖基-β-環(huán)糊精在3 400 cm-1左右的羥基吸收峰尖銳,這是由于糖基的引入后破壞了母體環(huán)糊精分子內(nèi)氫鍵,增加了改性環(huán)糊精的溶解度。通過(guò)1H NMR,13C NMR和HMBC譜進(jìn)一步確證了其結(jié)構(gòu)為單取代-6-O-α-D-葡萄吡喃糖基-β-環(huán)糊精。

      圖7 G3-β-CD 的 HMBC核磁共振圖Fig.7 HMBC spectrum of G3-β-CD

      圖8 G3-β-CD的HMBC核磁共振圖Fig.8 HMBC spectrum of G3-β-CD

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