于博，柏玉香，金征宇，吳月純，湯尚文，吳進(jìn)菊

1(湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽(yáng)，441053)2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

β－環(huán)糊精(β－CD)作為一類(lèi)重要的主體化合物，在食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工、分子識(shí)別、化學(xué)分析以及催化反應(yīng)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其獨(dú)特剛性空腔結(jié)構(gòu)能夠包和或部分包和客體分子，從而形成主－客體復(fù)合物，改變客體分子物理化學(xué)或生物學(xué)特性［1］。但β－CD水溶性較差而且其溶血效應(yīng)和非消化道安全性制約著其應(yīng)用范圍［2－4］。為了增加環(huán)糊精的水溶性，降低其對(duì)生理系統(tǒng)的不良影響，化學(xué)或生物改性環(huán)糊精是科學(xué)可行的解決方案。通常利用化學(xué)試劑或生物酶法將特定的分子基團(tuán)接枝到母體環(huán)糊精，一方面可以有效地增加其水溶性，另一方面，側(cè)鏈基團(tuán)的引入會(huì)降低或消除其溶血性和腎毒性。分支環(huán)糊精便是通過(guò)引入糖基來(lái)提高β－CD水溶解度的一種策略，葡萄糖基環(huán)糊精(G－β－CD)［5－6］、麥芽糖基環(huán)糊精(G2－β－CD)［7－12］、半乳糖基環(huán)糊精(Gal－β－CD)［13，14］、甘露糖基環(huán)糊精(Man－β－CD)［15］等已經(jīng)通過(guò)酶法制備得到。

本課題組利用普魯蘭酶的反向合成特性［16］，經(jīng)過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將麥芽三糖基引入到母體環(huán)糊精上獲得了麥芽三糖基－β－環(huán)糊精(G3－β－CD)，并對(duì) G3－β－CD進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

G3－β－CD 是以普魯蘭和 β－環(huán)糊精為底物，應(yīng)用普魯蘭酶水解和反向合成特性制備，并在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化;普魯蘭、β－環(huán)糊精，上海 Sigma－Aldrich公司;普魯蘭酶，杰能科生物工程有限公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HPLC－20AT，日本島津公司;NEXUS47傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo公司;Waters ZMD電噴霧質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司;AVANCE 400核磁共振儀，德國(guó)Bruker公司;AB135－S型電子分析天平，梅特勒－托利多儀器有限公司;Delta320 pH計(jì)，梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥芽三糖基－β－環(huán)糊精的純度分析

采用氨基柱進(jìn)行分析，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，泵為島津 LC－20A;色譜柱為 Lichrospher NH2(5 μm，4.6 mm ×250 mm);乙腈∶水(體積比 70∶30);柱溫選擇35°C;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 紅外光譜分析方法

采用KBr壓片法制備分析樣品，干燥樣品與KBr以1∶100的質(zhì)量比進(jìn)行混合研磨，壓片后置于NEXUS47傅里葉變換紅外光譜儀中，進(jìn)行測(cè)試。

1.3.3 電噴霧質(zhì)譜分析

采用電噴霧電離質(zhì)譜分析樣品分子質(zhì)量。在Waters ZMD電噴霧電離質(zhì)譜儀上，采用電噴霧式電離，電噴霧電壓為3.7 kV，離子源的溫度為120℃，脫溶溫度為300℃，離子能量選用1.0eV。

1.3.4 麥芽三糖基－β－環(huán)糊精的酶解分析

將10 mg G3－β－CD 溶解于 0.5 mL 乙酸－乙酸鈉緩沖溶液(20mmol/L、pH 5.0)中，加入普魯蘭酶，在50℃下孵育30 min，高溫滅活酶后，對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。

1.3.5 核磁共振分析方法

將G3－β－CD溶解于重水后，放置于5 mm內(nèi)徑的專(zhuān)用核磁管中，在AVANCE 400核磁共振儀上進(jìn)行的1H NMR，13C NMR和HMBC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的純度分析

如圖1所示，由本實(shí)驗(yàn)室所制備分離純化得到的G3－β－CD純度很高，根據(jù)HPLC峰面積積分，其純度＞99.5%。這表明本課題組所采用的G3－β－CD制備分離方法科學(xué)有效，這為進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 G3－β－CD 的 HPLC 圖Fig.1 HPLC of G3－β－CD

2.2 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的紅外光譜分析

如圖2所示，紅外光譜曲線(xiàn)從上到下依次是G3－β－CD、β－CD和麥芽三糖(G3)。圖2中3種成分的紅外光譜都顯示了糖類(lèi)的特征吸收峰，3 400 cm－1為O—H的伸縮振動(dòng)峰，2 927 cm－1為C—H伸縮振動(dòng)峰，1 640 cm－1為 O—H 彎曲振動(dòng)峰，1 150 cm－1為 CO振動(dòng)峰，這與糖類(lèi)結(jié)構(gòu)解析文獻(xiàn)中的報(bào)道一致［17］。圖2中845～855 cm－1波長(zhǎng)范圍出現(xiàn)的吸收峰主要是由α－糖苷鍵的特征吸收所引起的，在紅外譜圖中未出現(xiàn)β－糖苷鍵的特征吸收峰，這表明麥芽三糖基是以α型糖苷鍵與β－CD相連。從圖2中還可以看到，β－CD在3 400 cm－1左右的羥基吸收峰的峰形比G3－β－CD的峰形更寬，這主要是由于麥芽三糖基接枝到β－CD，部分地打開(kāi)了環(huán)糊精分子內(nèi)的氫鍵，致使峰形尖銳，而母體環(huán)糊精由于形成的分子內(nèi)氫鍵穩(wěn)定，化學(xué)鍵力常數(shù)小，從而在3 400 cm－1處產(chǎn)生寬而強(qiáng)的吸收。由于分子內(nèi)羥基所形成的氫鍵是阻礙環(huán)糊精分子水合的主要原因，側(cè)鏈基團(tuán)麥芽三糖基的引入部分地破壞了母體環(huán)糊精的分子內(nèi)氫鍵從而減少了分子水合阻礙，這有利于增加G3－β－CD在水中的溶解度。

圖2 G3－β－CD 的紅外光譜Fig.2 FTIR spectrum of G3－β－CD

2.3 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的電噴霧質(zhì)譜

根據(jù)電噴霧電離質(zhì)譜的一般規(guī)律，結(jié)合圖3中［M－H］+和［M］－的 m/z分別為1 619.5和1 621.5，可推斷出麥 G3－β－CD 的分子質(zhì)量為 1 620.5，這與G3－β－CD的理論分子質(zhì)量相一致。

圖3 G3－β－CD 的電噴霧質(zhì)譜Fig.3 ESIMS spectra of G3－β－CD in the negative and positive mode

2.4 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的酶解分析

為了進(jìn)一步確證產(chǎn)品G3－β－CD的結(jié)構(gòu)，采用普魯蘭酶水解G3－β－CD，酶解1 h后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，并與麥芽三糖、β－CD標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖比較，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的HPLC保留時(shí)間分別為12.359 min、16.212 min，這與麥芽三糖和β－CD標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相一致。這說(shuō)明本課題組所合成的G3－β－CD是由麥芽三糖和β－CD組成，結(jié)合電噴霧質(zhì)譜分析的分子量，可以推斷出G3－β－CD是由一分子麥芽三糖通過(guò)糖苷鍵與一分子β－CD相連接。

圖4 G3－β－CD 酶解產(chǎn)物的 HPLCFig.4 HPLC of G3－β－CD hydrolyzed with pullulanase

2.5 麥芽三糖基-β-環(huán)糊精的核磁共振分析

G3－β－CD 的1H NMR 分析如圖5所示，參照文獻(xiàn)［18－20］，對(duì) G3－β－CD 的質(zhì)子化學(xué)位移進(jìn)行歸屬。1H NMR譜中包含3種不同的端基質(zhì)子，分別為環(huán)糊精葡萄糖殘基A1～A7上的H－1(δ 4.95－4.9)、接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1上的的H－1(δ 4.8)和支鏈葡萄糖殘基 B2和 B3對(duì)應(yīng)的 H－1(δ 5.17，δ 5.23)，3 種類(lèi)型的端基質(zhì)子強(qiáng)度積分比為7∶1∶2，這說(shuō)明3種不同的葡萄糖殘基摩爾比為7∶1∶2。

G3－β－CD的13C NMR 分析如圖6所示，參照文獻(xiàn)［18－21］，對(duì) G3－β－CD 的碳信號(hào)進(jìn)行歸屬。G3－β－CD的13C NMR譜中包含3種不同的C－1信號(hào)，分別為環(huán)糊精葡萄糖殘基 A1～A7的 C－1(δ 103.05－102.76)，接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C－1(δ 99.68)和支鏈葡萄糖B2和B3的C－1(δ 101.06－100.87)，3種C－1的信號(hào)強(qiáng)度比為7∶1∶2。從13C NMR譜圖發(fā)現(xiàn)了2種C－6信號(hào)，一種來(lái)自環(huán)糊精葡萄糖殘基A1～A7和支鏈葡萄糖殘基B2和B3的C－6信號(hào)(δ 61.68－61.25)，一種來(lái)自接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C－6信號(hào)(δ 68.20)。由于吡喃糖殘基的C－6信號(hào)通常出現(xiàn)高磁場(chǎng)區(qū)域，δ 68.20出現(xiàn)的C－6信號(hào)明顯地向低場(chǎng)發(fā)生了移動(dòng)，這表明麥芽三糖基接枝在葡萄糖殘基B1上。

圖5 G3－β－CD 的1H 核磁共振圖Fig.5 1H NMR spectrum of G3－β－CD

圖6 G3－β－CD 的13C 核磁共振圖Fig.6 13C NMR spectrum of G3－β－CD

G3－β－CD的13C NMR 譜有4種 C－4的信號(hào)，分別為環(huán)糊精分子 A1～A7上的 C－4(δ 82.64－82.04)，接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C－4(δ 79.18)、支鏈葡萄糖殘基B2的C－4(δ 78.01)和支鏈最遠(yuǎn)端葡萄糖殘基B3的C－4(δ 70.45)，葡萄糖殘基B3的C－4由于遠(yuǎn)離環(huán)糊精主環(huán)，化學(xué)位移受糖苷鍵影響較小，很大程度保持了其原來(lái)的化學(xué)位移值。

HMBC譜可以揭示糖單元的連接方式，G3－β－CD的HMBC譜如圖7(a)所示。從圖7(a)中可以看出，環(huán)糊精分子葡萄糖殘基A1～A7的C－4與H－1在δ 82.32，5.06出現(xiàn)了多重耦合峰，C－1與H－4在δ103.02，3.58出現(xiàn)了多重耦合峰，表明產(chǎn)品中C－4與H－1、C－1與H－4相連，這表明環(huán)糊精分子的主環(huán)糖殘基以α－1，4糖苷鍵首尾相連。HMBC譜中接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C－6與環(huán)糊精葡萄糖殘基A7的H－1在 δ 68.20，4.93出現(xiàn)單一耦合峰(圖7(b))，這表明該葡萄糖殘基 B1和A7以 α－1，6糖苷鍵相連。接枝點(diǎn)葡萄糖殘基B1的C－4與支鏈葡萄糖殘基B2的H－1在δ 79.18，5.32出現(xiàn)單一耦合峰(圖7(c))，這表明葡萄糖殘基 B1和 B2是以 α－1，4糖苷鍵相連。綜合以上分析可以得出結(jié)論G3－β－CD的結(jié)構(gòu)為單取代－6－O－α－D－麥芽三糖基－β－環(huán)糊精(圖8)。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò) HPLC鑒定，G3－β－CD 的純度達(dá)到 99%以上，這表明本課題組所設(shè)計(jì)的制備和分離方案科學(xué)有效。通過(guò)電噴霧質(zhì)譜的分析，可計(jì)算出 G3－β－CD的分子質(zhì)量為1 620.5，這與其理論分子質(zhì)量相一致。結(jié)合酶解產(chǎn)物的HPLC分析和紅外光譜，可知產(chǎn)物有一分子的麥芽三糖通過(guò)α型糖苷鍵與β－CD連接而成，紅外譜圖中麥芽三糖基－β－環(huán)糊精在3 400 cm－1左右的羥基吸收峰尖銳，這是由于糖基的引入后破壞了母體環(huán)糊精分子內(nèi)氫鍵，增加了改性環(huán)糊精的溶解度。通過(guò)1H NMR，13C NMR和HMBC譜進(jìn)一步確證了其結(jié)構(gòu)為單取代－6－O－α－D－葡萄吡喃糖基－β－環(huán)糊精。

圖7 G3－β－CD 的 HMBC核磁共振圖Fig.7 HMBC spectrum of G3－β－CD

圖8 G3－β－CD的HMBC核磁共振圖Fig.8 HMBC spectrum of G3－β－CD

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