豬CCKAR基因兩SNP位點的遺傳多態(tài)性分析

彭 興，譚岳華，黃生強*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2. 畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3. 廣西揚翔農(nóng)牧有限責任公司，廣西 貴港 537100）

隨著人們生活水平的不斷攀升，消費者對豬肉的品質(zhì)要求越來越高。20世紀70 年代以來，由于人們在分子數(shù)量遺傳學、分子生物學技術(shù)方面的不斷發(fā)展和完善人們發(fā)現(xiàn)盡管基因的編碼區(qū)是相對保守的序列。但在漫長的生物進化過程中，由于環(huán)境和機體的相互作用, 不可避免地產(chǎn)生了基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)種屬間的差異和種屬內(nèi)的變異，構(gòu)成了基因的多態(tài)性?；蚪MDNA 中單個堿基的顛換或轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，簡稱SNP),從而致使基因多態(tài)性的出現(xiàn)?；虻亩鄳B(tài)性又決定了其蛋白的多態(tài)性，進而影響基因的功能。伴著基因組學和SNP 檢測技術(shù)[1]的發(fā)展，使得現(xiàn)在對SNP 位點的研究達到了一個新的高度。

豬縮膽囊素受體基因[2],定位于豬八號染色體上[3]，與人類的同源性達到90%以上[4]。大量實驗證明膽囊收縮素A 受體基因（cholecystokinin type-A r eceptor，簡稱 CCKAR）與動物的日采食量和平均日增重有明顯的關(guān)聯(lián)[5-9]1555，Takiguchi 通過研究還發(fā)現(xiàn)CCKAR 基因能維持動物體內(nèi)的血糖濃度[10]。本研究以杜洛克、大白、長白3 個外來品種及其雜交得到的品系杜長大(DLY)，湖南省4 個地方品種：寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源黑豬和海南地方豬五指山豬共9 個品種/群體為研究對象，采用PCR-RFLP 方法分析了CCKAR 基因+179A/G 位點和+471C/G 位點的遺傳多態(tài)性及基因頻率和基因型頻率以及該基因多態(tài)性以揭示我省不同豬群的基因多樣性。此試驗研究目的重點在于利用分子遺傳學和數(shù)量遺傳學知識作為技術(shù)手段，以CCKAR 基因為目的研究基因，探討CCKAR 基因不同SNP 位點的遺傳多態(tài)性，為進一步研究CCKAR 基因與豬肉質(zhì)性狀和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中的試驗豬為益陽農(nóng)科所種豬場和正虹種豬場提供，共計9 個品種/群體687 頭豬。其中地方品種包括寧鄉(xiāng)豬22 頭、桃源黑豬133 頭、大圍子豬72 頭、沙子嶺豬69 頭，海南五指山豬65 頭；外來品種含杜洛克豬94 頭、大白豬104 頭、長白豬69 頭、杜長大雜交豬59 頭。采取供試豬耳組織并提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 CCKAR 基 因+179A/G位點和+471C/G 位點基因PCRRFLP

根據(jù)GenBank DQ496228 序列設(shè)計CCKAR 基 因+179A/G 位 點和+471C/G 位點PCR，以豬基因組DNA 為模板進行擴增。

+179A/G 位點引物F 和R 序列：

上游引物F：

CTTGGGAGACTCTGCAGTCC

下游引物R：

GGGCTGATCCAAACAGAAAA

+471C/G 位點引物F'和R'序列：

上游引物F'：

TGAATGGGAGCAACATCACT

下游引物R'：

CATCCTCTTGTTTCGAATCAGC

取擴增產(chǎn)物進行電泳驗證，對CCKAR 基因+179A/G 位點和+471C/G 位點擴增的目的片段進行回收純化。然后分別利用限制性內(nèi)切酶 Hpy8I 和SatI 進行酶切，并將酶切產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳以進行基因型的判定。

1.2.2 CCKAR 基 因+179A/G 位點和+471C/G 位點基因統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計CCKAR 基因+179A/G 位點及+471C/G 位點2 個不同SNP 位點基因型檢出個體數(shù)，計算群體遺傳純合度、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量以及Hpy8I 和SatI 酶切位點的基因型頻率和基因頻率，并進行卡方(χ2)檢驗。

表1 不同品種CCKAR 基因+179A/G 位點的Hardy-Weinberg 平衡檢驗

表2 不同品種CCKAR 基因+179A/G位點多態(tài)性

表3 不同品種 CCKAR 基因+471C/G 位點的Hardy-Weinberg 平衡檢驗

表4 不同品種CCKAR 基因+471C/G位點多態(tài)性

2 結(jié)果與分析

2.1 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩 位 點 的PCR 擴 增 及RFLP 結(jié)果

2.1.1 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩位點PCR 擴增產(chǎn)物的檢測

利用PCR 技術(shù)，從豬基因組DNA擴增得到包含CCKAR 基因+179A/G位點和+471C/G 位點2 個片段的長度分別為200 bp 和900 bp。這2 個片段經(jīng)電泳檢測與預期結(jié)果一致（見圖1 和圖2）。并對產(chǎn)物進行純化回收準備用于下游實驗。

2.1.2 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩位點的RFLP 結(jié)果

對CCKAR 基 因+179A/G 位 點擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Hpy8I 酶切，再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果顯示：在CCKAR 基因+179A/G 位點上存在3 種基因型 AA基因型（110 bp、90 bp）、AG 基因型（110 bp、90 bp、55 bp、55 bp）和GG基因型（90 bp、55 bp、55 bp）（見圖3）。

對CCKAR 基因+471C/G 位點擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SatI 酶切，再通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果顯示：在CCKAR 基因+471C/G 位點上存在3 種基因型：CC基 因 型（500 bp、300 bp、100 bp）、CG基因型（500 bp、300 bp、100 bp、280 bp、220 bp）和GG基因型（300 bp、280 bp、220 bp、100bp）（見圖4）。

2.2 豬CCKAR 基因不同位點的遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 CCKAR 基 因+179A/G 位點的Hardy-Weinberg 平衡檢驗和位點多態(tài)性

按 照 公 式p=D+H/2 與q=R+H/2，分別計算CCKAR 基因+179A/G 位點 （Hpy8I 酶切位點）在各品種中等位基因A 和等位基因G 的頻率，并對9 個豬品種/品系樣本Hpy8I 酶切位點的基因型分布進行卡方檢驗(見表1)。

由表1 可以看出，5 個地方品種（寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源豬、五指山豬）的等位基因G 的頻率均高于3 個外來品種（杜洛克豬、長白豬、大白豬）且寧鄉(xiāng)豬等位基因G 的頻率最高達到了0.818 2。從基因型的分布看，GG 型在地方品種、外來品種和杜長大雜交種中均為主要基因型，其中五指山豬GG 基因型頻率最高（0.707 7）；AA基因型在各品種中的都比較少，其中寧鄉(xiāng)豬中沒有檢測到AA 基因型，這有可能是由于樣本含量太小所致。

由表2 可以看出，CCKAR 基因+179A/G 位點上所有品種的遺傳純合度均高于0.5，其中寧鄉(xiāng)豬的遺傳純合度最高（0.702 5），杜洛克豬的遺傳純合度最低（0.541 3），遺傳雜合度正好相反。從有效等位基因數(shù)上看，3 個外來品種的有效等位基因數(shù)均高于地方品種，其中杜洛克豬的最高(1.847 6)寧鄉(xiāng)豬的最低(1.423 5)；從多態(tài)信息含量上看，各個品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間，說明在該位點上各品種具有遺傳多態(tài)性，且遺傳變異較大。

2.2.2 CCKAR 基 因+471C/G 位點的Hardy-Weinberg 平衡檢驗和位點多態(tài)性

按照上述方法計算CCKAR 基因+471C/G 位點 SatI 酶切位點上的各品種等位基因C 和等位基因G 的頻率，并對9 個豬品種/品系樣本SatI 酶切位點的基因型分布進行卡方檢驗(見表3)。

由表3 可以看出，在5 個地方品種中，CC 基因型頻率均高于GG 型基因頻率；而在外來品種和杜長大雜交群當中正好相反。在實驗所檢測的9 個豬品種中大圍子豬CG 基因型頻率最高（0.638 9），杜洛克豬CG 基因型頻率最低（0.457 4）。從等位基因分布頻率來看，在5 個地方品種中五指山豬等位基因C 基因頻率最高（0.592 3）；在3 個外來品種中杜洛克豬G 基因頻率最高（0.633 0）；在杜長大雜交豬中，等位基因G 基因頻率為0.550 8。

從表4 不難發(fā)現(xiàn)，在CCKAR 基因+471C/G 位點上所有品種的遺傳純合度相差不大且均略高于0.5。其中杜洛克豬的遺傳純合度最高（0.535 4），大圍子豬的遺傳純合度最低（0.501 5）；從有效等位基因數(shù)上看，所有品種的有效等位基因數(shù)都比較高，其中大圍子豬的有效等位基因數(shù)最高(1.993 8)，杜洛克豬的有效等位基因數(shù)最低（1.867 9）；從多態(tài)信息含量上看，各個品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間。

3 討論與結(jié)論

隨著這些年傳統(tǒng)表型選育持續(xù)進行，分子育種技術(shù)也在不斷地進步，在育種中的應用也逐漸增加[11]。豬CCKAR 基因能夠控制動物的進食量、飽感以及肥胖，被認為是豬生產(chǎn)性能的候選基因[5]。本試驗還對2 個SNP 位點進行了Hardy-Weinberg 平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)所有品種都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明了所采樣本來自一個孟德爾群體，采樣具有代表性。

從豬CCKAR 基因+179A/G 位點的遺傳分析結(jié)果可以看出：不論是在地方豬種、外來品種還是雜交品種中，等位基因G 都是優(yōu)勢基因。外來品種中G 等位基因頻率都比地方品種中G 等位基因頻率低，究其原因可能是由于地方品種相對于外來品種在進化過程當中保守程度不一所造成的，也有可能是由于地方品種和外來品種的不同選育方法和程度所造成。在所檢測的9 個品種中，GG 型基因型為優(yōu)勢基因型，AA基因型在各品種中分布較少，其中寧鄉(xiāng)豬中沒有檢測到AA 基因型，這可能是由于樣本采集過于集中或者含量太小所致。在除寧鄉(xiāng)豬以外的8 個豬種群體中，CCKAR 基因+179A/G Hpy8 I 酶切位點均存在較豐富的遺傳多態(tài)性，但多態(tài)分布程度有一定的差異，這可能與豬種的選育、豬品種在該位點遺傳品質(zhì)的純合性、進化的保守性等有關(guān)。

CCKAR 基 因+471C/G 位 點 的遺傳分析結(jié)果表明：在基因型分布上，CG 基因型分布占所有品種的比重為56%為優(yōu)勢基因型；所有品種在該位點上的C、G 等位基因頻率相差不大。在地方豬種中，等位基因C 為優(yōu)勢基因；在外來品種和雜交品種中，等位基因G為優(yōu)勢基因。在地方品種中CC 基因型頻率比GG 基因型頻率高，而在外來品種中則出現(xiàn)了相反的現(xiàn)象。造成此現(xiàn)象的原因可能是因為外來品種和雜交品種是經(jīng)長期人工選育而來，人為的選擇增加了有利于提高生長速度的G 等位基因的頻率，而地方品種中由于選育程度較低，所以G 等位基因頻率相對要低。這也正符合Houston 等人的研究發(fā)現(xiàn)，+471C/G 位點與日采食量和平均日增重密切相關(guān)，且+471G 相對于+471C等位基因的豬具有更快的生長速度和更大的食欲[5]1561。所有品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間，說明在該位點上各品種具有較豐富的遺傳多態(tài)性，且遺傳變異較大。該位點C、G 等位基因在所有地方品種和外來品種中都普遍存在，說明該位點的堿基取代應該發(fā)生在品種分化之前。

本實驗研究了9 個品種，共計687頭豬CCKAR 基因+179A/G Hpy8I酶切位點和+471C/G SatI 酶切位點的基因頻率和基因型頻率，為研究豬CCKAR 基因與豬肉質(zhì)、胴體等經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了很好的材料。

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