• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      潮州地區(qū)人乳頭瘤病毒52型L1基因多態(tài)性分析

      2013-11-24 02:20:20羅招云楊立業(yè)陳默蕊
      關(guān)鍵詞:基因庫(kù)進(jìn)化樹潮州

      羅招云,陳 強(qiáng),楊立業(yè),林 敏,陳默蕊

      (1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州中心醫(yī)院 檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,廣東 潮州521000;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

      宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,僅次于乳腺癌占惡性腫瘤的第二位[1]。研究證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的最重要危險(xiǎn)因素[2]。目前關(guān)于16及18型HPV的報(bào)道很多,對(duì)52型的研究較少見。HPV52作為HPV16簇群中的成員,具有高度致癌性的HPV型別,在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況,逐漸引起人們的關(guān)注。HPV52是潮州地區(qū) HR-HPV優(yōu)勢(shì)基因型別(30.55%,1005/3290)[3]。由于 HPV52與不同遺傳背景的宿主相互作用會(huì)引起病毒的變異,影響HPV感染和轉(zhuǎn)歸,了解HPV52基因多態(tài)性將為明確宮頸癌的發(fā)生和運(yùn)用免疫學(xué)策略預(yù)防HPV52相關(guān)疾病提供新的思路。由于源于中國(guó)內(nèi)地的HPV52基因序列較少,本研究在潮州地區(qū)采集女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,進(jìn)行HPV分型和HPV52L1測(cè)序,將所獲得的HPV52L1序列與GenBank基因庫(kù)中的聯(lián)合進(jìn)行系統(tǒng)全面分析,探討HPV52L1基因多態(tài)性。

      1 材料與方法

      1.1 樣本來源 取自2009年8月至2010年8月間潮州地區(qū)農(nóng)村女性宮頸癌篩查的49458份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本(年齡35~60歲,平均46.98歲,均為生育女性,先前均無宮頸手術(shù)史)。先進(jìn)行HR-HPV 13種高危型別的實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩查(杭州博日),陽性者再進(jìn)行21型核酸分子快速導(dǎo)流雜交分型檢測(cè)(凱普生物技術(shù)有限公司)。HR-HPV陽性者同時(shí)進(jìn)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(LCT)。LCT檢查采用廣州安必平醫(yī)藥公司提供的制片儀器(LBP-2801)及其配套試劑,以 The Bethesda System(TBS)報(bào)告系統(tǒng)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇單純HPV52型感染陽性的標(biāo)本為研究對(duì)象。

      1.2 標(biāo)本的采集 此次宮頸癌篩查活動(dòng)通過了潮州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。標(biāo)本采集前由受檢者簽署知情同意書。由專科醫(yī)生使用凱普公司專用宮頸刷完成。擴(kuò)陰器暴露宮頸口后,棉拭子擦去分泌物,宮頸刷順時(shí)針?biāo)⑥D(zhuǎn)3~5圈后將宮頸刷保存于樣品管的保存液中。

      1.3 DNA模板的制備 DNA提取試劑盒(凱普公司生物技術(shù)有限公司),標(biāo)本制備按說明書操作。

      1.4 目的序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序 HPV52L1PCR以上述提取DNA為模板。HPV52L1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank基因庫(kù)天津參考株(TJ49-52,ACCESSION:GQ472848)序列設(shè)計(jì)特異性引物,并經(jīng)Primer5.0分子生物學(xué)軟件分析優(yōu)化。參考Gen-Bank基因庫(kù)中HPV52L1區(qū)通用型引物 MY09/MY11, MY09:5’-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’, MY11: 5 ’-GCMCAGGGWCATA-AYAATGG-3’;因L1基因序列全長(zhǎng)1590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,自行設(shè)計(jì)HPV52L1區(qū)段特異引物正反向4對(duì),分別為HPV52-L1-1,

      F:5′-CCATTACCTTCGTTACCCACA-3′,

      R:5′-AGGATGCCCACTAATACCC-3′HPV52-L1-2,

      F:5′-GCTTGGAAATCGGTAGGG-3′,R:5′-GCAGTATTGCCAGAGTTAGACC-3′HPV52-L1-3,

      F:5′-AGGGTCTAACTCTGGCAATAC-3′,

      R:5′-CCTGTAGCCCTGCCTGTA-3′HPV52-L1-4,

      F:5′-ATGAAAATTTTAAGGAATACC -3′,

      在2017—2018秋季學(xué)期“生物化學(xué)”課程的教學(xué)中,采用“大班授課、小班研討”、“設(shè)計(jì)問題和案例”、“網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)師生互動(dòng)”、“改變成績(jī)?cè)u(píng)價(jià)體系”等方面的教學(xué)改革,在提高大班型授課效率方面取得了一定成效,并對(duì)上課模式和效果進(jìn)行了無記名問卷調(diào)查,向參與的學(xué)生(參與傳統(tǒng)教學(xué)問卷為120人,參與教學(xué)改革后問卷為110人)提出了5個(gè)問題。

      R:5′-ACATACATAACATGCAAACAAC-3′上述引物均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司(上海)合成。PCR擴(kuò)增儀為ABI2700熱循環(huán)儀。L1基因PCR反應(yīng)條件:50μl反應(yīng)體系(包含2μl模板DNA,滅菌去離子水34.0μl,10×PCR Buffer 5.0 μl,dNTPs 4.0μl(0.2mmol/L),DMSO為1μl,引物P1,P2各1.6μl(0.4μmol/L),Taq DNA 聚合酶1U/0.8μl);L1-1反應(yīng)條件為:93℃5min后進(jìn)行循環(huán),93℃1min,52℃1min,72℃1min,36個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果并照相。L1-2、L1-3、L1-4的反應(yīng)條件與 L1-1只有第三步的退火溫度不同,分別為 L1-2(52℃),L1-3(57℃),L1-4(57℃),其它步驟與 L1-1完全一致。HPV52 L1PCR反應(yīng)產(chǎn)物送廣州英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司雙向測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。Taq酶、dNTPs、PMD18-T載體為TakaRa公司產(chǎn)品。

      1.5 HPV52L1區(qū)段序列測(cè)定 因L1序列全長(zhǎng)1 590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,分別用L1-1、L1-2、L1-3、L1-4進(jìn)行 DNA 測(cè)序,測(cè)序后再拼接。利用BLAST將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中HPV52序列進(jìn)行比對(duì)。

      1.6 序列分析 通過BioEdit軟件工具向Gen-Bank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提交,利用BLAST和DNA STAR等在線分析工具對(duì)所獲得序列進(jìn)行分析,將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中天津參考株(ACCESSION:GQ472848)的HPV52L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)出現(xiàn)的變異進(jìn)行多態(tài)性分析。本研究獲得的73株組成數(shù)據(jù)集,合并全同序列,然后分組。將潮州地區(qū)的HPV52L1變異株基因序列上交NCBI GenBank基因庫(kù)。

      1.7 建立 HPV52-L1進(jìn)化樹 通過BioEdit、Clustal-1.8和 Mega-5.05軟件工具,以及利用 NCBI→BLAST在線分析工具,按照構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的步驟操作。

      2 結(jié)果

      2.1 HPV52L1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果及初步鑒定以選取的101例HPV52單純感染者宮頸脫落細(xì)胞 DNA 為模板,成功獲得 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4各83份PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為:L1-1為526bp、L1-2為547bp、L1-3為596 bp、L1-4為560bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后,分別在相應(yīng)位置附近顯示一條特異DNA條帶,其大小與預(yù)期值一致,見圖1。

      圖1 HPV52-L1中4片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

      2.2 HPV52-L1序列測(cè)定和分析 將83份L1-1、L1-2、L1-3、L1-4PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行正、反雙向測(cè)序,成功獲得正、反各73條 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4基因序列,利用BioEdit和DNA STAR等在線分析軟件將 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4再拼接成 HPV52 L1全序列。利用DNA STAR/Edit Seq軟件分析,以天津參考株L1編碼區(qū)序列中起始密碼和終止密碼處小片段,找到相對(duì)應(yīng)的起始密碼和終止密碼,起始密碼和終止密碼之間的基因序列就是所測(cè)的L1編碼區(qū)序列,再利用BLAST在線分析工具,將HPV52L1基因序列與GenBank收錄的天津參考株L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì),一致性均為99%。對(duì)73條HPV52L1核苷酸序列進(jìn)行同源性分析,L1基因型內(nèi)核苷酸同源性為99.1%~99.9%,符合分型規(guī)律[4]。

      表1 HPV52-L1基因測(cè)序結(jié)果與潮州地方株比對(duì)堿基突變類型和位置

      2.4 HPV52L1 15組序列進(jìn)化樹之間的關(guān)系 進(jìn)化樹中上部分的潮州地區(qū)的12組編碼序列與廣州的、天津的、浙江等國(guó)內(nèi)的和泰國(guó)、印度等東南亞國(guó)報(bào)道株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹中下部分的CZ52D416組編碼序列與 TJ49-52(GQ472848)株和 Qv03594(HQ537740)株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹下部分的2組(CZ52E928、CZ52E136)編碼序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等美歐國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近,見圖2。

      圖2 HPV52-L1 15組序列進(jìn)化樹

      2.5 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和73株感染者的LCT結(jié)果 將潮州地區(qū)15株不同的HPV52 L1變異株基因序列上交GenBank基因庫(kù),獲得15株 的 Accession 號(hào),GenBank accession codes:JN874416、JN874417、JN874419 ~ JN874428、JN874430、JN874434、JN874436。為了了解 HPV52 L1變異株的致瘤性,比較不同的HPV52L1變異株群的宮頸病變嚴(yán)重程度差別,其中CZ52A105組中有1例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesions,HSIL),CZ52A277組為1例鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell cancer,SCC)見表2。

      3 討論

      研究表明HPV52在中國(guó)和亞洲婦女中常見[5]。某些地區(qū)甚至高于 HPV16和 HPV18,在上海、四川、廣東等地,高發(fā)態(tài)勢(shì)尤為明顯[6]。HPV52作為HPV16簇群中的成員,是具有高度致癌性的HPV型別之一[7],在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況。L1基因是HPV晚期結(jié)構(gòu)蛋白基因,有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性,能誘導(dǎo)機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,從而阻斷病毒感染,因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原[8]。研究證實(shí),不同地域間HPV L1基因存在變異現(xiàn)象[9]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州地區(qū)L1基因存在7處變異[10]。本研究發(fā)現(xiàn),潮州地區(qū)HPV52L1基因序列有31處堿基分別出現(xiàn)變異,其中6處由于核苷酸的改變,其編碼氨基酸也相應(yīng)發(fā)生變化;另外25處為同義突變,未影響氨基酸的改變。提示HPV52L1編碼基因中可能存在一系列中國(guó)地區(qū)的高頻率突變位點(diǎn);結(jié)果也提示潮州地區(qū)不同L1基因序列之間存在差異,特別是氨基酸的改變,可能會(huì)造成HPV52L1蛋白免疫原性的差異。有學(xué)者報(bào)道HPV不同的變異株與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)程度相關(guān)[11]。HPV16的亞美或非洲變異株比歐洲變異株具有更強(qiáng)的發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)性[12]。本研究分析了潮州地區(qū)HPV52L1基因的突變譜及主流型,并預(yù)測(cè)了其功能變化。L1蛋白的改變將導(dǎo)致病毒的組裝、感染以及抗原表位的改變,使病毒逃避機(jī)體免疫識(shí)別,從而造成病毒的持續(xù)和重復(fù)感染,促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生[13]。提示L1基因突變?yōu)镠PV52型種系發(fā)生提供了確鑿的資料,也為HPV52型預(yù)防性疫苗研制提供新的思路和基本條件。潮州地區(qū)的L1基因多態(tài)性形成15種突變模式,分為東亞和歐洲2種譜系。主流突變的東亞群L1基因序列多與國(guó)內(nèi)的(廣州、天津、浙江等)和東南亞地區(qū)(泰國(guó)、印度、香港、臺(tái)灣等)報(bào)道的HPV52株同源;歐美群L1基因序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等歐美國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近。說明不僅在不同國(guó)家之間,即便在我國(guó)不同地區(qū)之間和不同檢測(cè)對(duì)象之間,L1基因多態(tài)性也存在較大的差異。

      表2 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和LCT結(jié)果(n=73)

      綜上所述,HPV52在亞洲CIN發(fā)生中可能占據(jù)重要地位。本研究探明了潮州地區(qū)HPV52L1基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和變異規(guī)律,為制備適合中國(guó)人群的HPV宮頸癌疫苗提供流行病學(xué)資料和理論依據(jù)。

      [1]Renshaw AA,Young NA,Birdsong GG,et al.Comparison of performance of conventional and ThinPrep gynecologic preparations in the College of American Pathologists Gynecologic Cytology Program[J].Arch Pathol Lab Med,2004,128(1):17.

      [2]趙戴君,龔向真,胡爭(zhēng)光,等.上海市社區(qū)子宮頸人乳頭瘤病毒感染現(xiàn)況及危險(xiǎn)因素研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(10):1867.Zhao DJ,Gong XZ,Hu ZG,et al.The prevalence study on the human papillomavirus(HPV)infection and the risk factors of the community female popμlation in Shanghai[J].Modern Preventive Medicine,2010,37(10):1867.

      [3]羅招云,楊立業(yè),翁妙珊,等.潮州地區(qū)人乳頭瘤病毒型別分布特征分析[J].分子診斷與治療雜志,2011,3(3):177.Luo ZY,Yang LY,Weng MS,et al.Analysis of subtypes distribution of human papillomavirus in Chaozhou area[J].Journal of Molecμlar Diagnostics and Therapy,2011,3(3):177.

      [4]Bernard HU,Burk RD,Chen Z,et al.Classification of papillomaviruses(PVs)based on 189PV types and proposal of taxonomic amendments[J].Virology,2010,401:70.

      [5]Onuki M,Matsumoto K,Satoh T,et al.Human papillomavirus infections among Japanese women:age-related prevalence and typespecific risk for cervical cancer[J].Cancer Sci,2009,100(7):1312.

      [6]Lai C H,Huang H J,Hsueh S,et al.Human papillomavirus genotype in cervical cancer:apopμlation-based study[J].Int J Cancer,2007,120(9):1999.

      [7]Bouvard V,Baan R,Straif K,et al.A review of human carcinogens-Part B:biological agents[J].Lancet Oncol,2009,10(4):321.

      [8]劉錫光,劉忠,田厚文,主編.人乳頭瘤病毒感染及其防治[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009,225-229.Liu XG,Liu Z,Tian HW,chief editor.Infection and preventive of human papillomavirus[M].First published.Beijing:People health publishing company,2009,225-229.

      [9]Icenogle JP,Sathya P,Miller DL,et al.Nucleotide andamino acid sequence variation in the LI and E7open reading frames of human papillomavirus type 6and type 16[J].Virology,1991,184(1):101.

      [10]Mayrand MH,Coutlee F,Hankins C,et al.Detection of human papillomavirus type 16DNA in consecutive genital samples does not always represent persistent infection as determined by molecμlar variant analysis[J].J Clin Microbiol,2000,38:3388.

      [11]Schiffman M,Rodriguez AC,Chen Z,et al.A Popμlation-Based Prospective Study of Carcinogenic Human Papillomavirus Variant Lineages,Viral Persistence,and Cervical Neoplasia[J].Cancer Res,2010,70:3159.

      [12]Sichero L,F(xiàn)erreira S,Trottier H,et al.High grade cervical lesions are caused preferentially by non-European variants of HPVs 16and 18[J].Int J Cancer.2007;120:1763.

      [13]馬正海,張富春,梅新娣,等.新疆南部地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16型L1基因突變譜分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(12):987.Ma ZH,Zhang FC,Mei XD,et al.Analysis of Human Papillomavirus 16E6Oncogene Mutation in Xinjiang Uygur Women with Cervical Carcinoma[J].Chinese Medical Journal,2004,84(12):987.

      猜你喜歡
      基因庫(kù)進(jìn)化樹潮州
      天然生物物種基因庫(kù):重慶五里坡國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)
      潮州樂調(diào)的音階流變梳理與分析
      我國(guó)最大藜麥基因庫(kù)落戶山西農(nóng)谷
      基于心理旋轉(zhuǎn)的小學(xué)生物進(jìn)化樹教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
      常見的進(jìn)化樹錯(cuò)誤概念及其辨析*
      8個(gè)基因庫(kù)逾萬分種子10月入庫(kù)Svalbard全球種質(zhì)庫(kù)
      潮州手拉壺“飛鴻”的象征意義
      潮州優(yōu)質(zhì)楊梅高接換種技術(shù)
      艾草白粉病的病原菌鑒定
      中國(guó)首個(gè)國(guó)家基因庫(kù)開始運(yùn)營(yíng)
      永顺县| 灵丘县| 定南县| 团风县| 汾西县| 马山县| 涟水县| 天全县| 上林县| 曲周县| 平原县| 务川| 铜梁县| 克东县| 得荣县| 化隆| 陵川县| 舟山市| 莱西市| 郴州市| 澄江县| 沙湾县| 丰台区| 宜兴市| 大丰市| 南宁市| 花莲县| 南开区| 多伦县| 和林格尔县| 海宁市| 安图县| 开鲁县| 鸡泽县| 兴海县| 南川市| 碌曲县| 津市市| 遂昌县| 道真| 钟山县|