成文召，麻艷芳，邵鄰相，趙鐵軍，張均平，徐玲玲，呂學(xué)維

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

佛手(fingered citron)為蕓香科(Rutaceae)柑桔屬灌木香櫞(Citrus medica L.)的變種.佛手是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材，其葉、花、果實(shí)均可入藥，具有化痰止咳、舒肝和胃、理氣止吐等功效［1］.佛手中揮發(fā)油含量較高，主要成分是烯烴類化合物［2-3］.現(xiàn)代研究表明佛手果實(shí)中揮發(fā)油具有延緩衰老［4］、增強(qiáng)機(jī)體免疫力［5］、抗癌［6-7］、抑菌［8-9］和鎮(zhèn)靜［10］等作用.已有的研究報(bào)道側(cè)重于佛手果實(shí)中的揮發(fā)油成分和生物活性，但有關(guān)佛手葉揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞影響的研究尚無(wú)報(bào)道.本文著重探討了佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 癌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響，為佛手資源的綜合利用和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 佛手葉揮發(fā)油制備

新鮮佛手葉洗凈勻漿，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，無(wú)水硫酸鈉干燥，4 ℃保存.精確稱取佛手葉揮發(fā)油100 mg，加入10 μL 吐溫-80，渦旋震蕩混勻，磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mL，過(guò)濾滅菌，用DMEM 純培養(yǎng)基稀釋至所需濃度.

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)，吐溫-80，二甲基亞砜(DMSO)，Hoechst 33342，碘化丙啶(PI)，戊二醛，Triton X-100，牛血清白蛋白(BSA)，Anti-α-Tubulin 鼠多克隆抗體(Sigma 公司);Alexa Fluor?488 驢抗鼠IgG，防熒光淬滅劑(Invitrogen 公司).3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，1500 型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo 公司);Eclipse E600 型熒光顯微鏡(日本Nikon 公司);KYKY-1000B 型掃描電子顯微鏡(中國(guó)科學(xué)院科學(xué)儀器廠);H-600 透射電子顯微鏡(日本日立公司);TCS SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Leica 公司).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

HeLa 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(含100 μg/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)中，在37 ℃，5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).細(xì)胞以1 ×104/孔接種于96 孔板中，以5 ×105/孔接種于含潔凈蓋玻片的6 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，各組加入相應(yīng)量的藥物使其終質(zhì)量濃度為200，400 和800 μg/mL，同時(shí)設(shè)0.01%吐溫-80 對(duì)照組，24 h 后檢測(cè).

1.4 噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活力

佛手葉揮發(fā)油作用于細(xì)胞6，12 和24 h 后，每孔加入1 mg/mL 噻唑藍(lán)溶液20 μL，孵育4 h后，棄培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩15 min，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A 值，按下式計(jì)算抑制率:

1.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細(xì)胞24 h 后，倒置顯微鏡觀察，拍照.

1.6 熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)

取細(xì)胞爬片，滴加Hoechst 33342 染液(5 μg/mL)和PI 染液(5 μg/mL)，避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察，拍照.

1.7 掃描電鏡觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［7］.

1.8 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)

細(xì)胞以2.5%戊二醛溶液、2%瓊脂溶液、1%鋨酸溶液依次固定，乙醇梯度脫水，包埋，切片，透射電鏡觀察，拍照.

1.9 免疫熒光檢測(cè)微管纖維結(jié)構(gòu)與分布

取細(xì)胞爬片，磷酸鹽緩沖液清洗3 ×2 min;3.7%甲醛溶液4 ℃固定過(guò)夜;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×5 min;0.2% Triton X-100 溶液透膜5 min;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×5 min;5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min;α-Tubulin 鼠多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×8 min;Alexa Fluor?488 驢抗鼠IgG(1∶1 000)室溫避光孵育30 min;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×8 min;雙蒸水漂洗2 次;加入防熒光淬滅液，4 ℃晾干，指甲油封片，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，拍照.

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.P ＜0.05為差異有顯著性意義，P ＜0.01 為差異有極顯著性意義.

2 結(jié)果

2.1 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示:0.01%吐溫對(duì)照組抑制率不明顯;31.25 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細(xì)胞6，12 和24 h 后，抑制率分別為7.41%，9.12%和6.10%，抑制率變化不明顯;62.5 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細(xì)胞24 h 后，抑制率為10.61%，與對(duì)照組相比差異極顯著(P ＜0.01);125，250 和500 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa癌細(xì)胞6，12 和24 h 后，抑制率隨著揮發(fā)油質(zhì)量濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大.表明低劑量佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，而中、高劑量的佛手葉揮發(fā)油能夠抑制HeLa 細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性.

圖1 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖的影響

2.2 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖2 可見:對(duì)照組與陰性對(duì)照組(A，B)細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞大而飽滿，形態(tài)規(guī)則，伸展性好，貼壁牢固;陽(yáng)性對(duì)照組(C)細(xì)胞體積縮小，呈懸浮狀態(tài)，形態(tài)不規(guī)則，有凋亡小體產(chǎn)生;200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油組(D)細(xì)胞貼壁性差，細(xì)胞皺縮聚集成團(tuán)，有凋亡小體出現(xiàn);400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細(xì)胞體積縮小，多數(shù)呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞碎片增多;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細(xì)胞扁平溶脹，立體感下降，內(nèi)容物外泄，出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，表明細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞.

圖2 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞形態(tài)的影響(Bar=50 μm×200)

2.3 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞核的影響

由圖3 可見:對(duì)照組與陰性對(duì)照組(A，B)染色呈均一的弱藍(lán)色熒光，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，多呈橢圓形;陽(yáng)性對(duì)照組(C)細(xì)胞核成團(tuán)堆積，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集分布在核邊緣，染色呈亮藍(lán)色團(tuán)塊;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細(xì)胞核體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝集邊緣化，與陽(yáng)性對(duì)照類似;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細(xì)胞核輪廓模糊，少數(shù)染色質(zhì)邊集化，大多數(shù)染色質(zhì)裂解呈碎片;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)出現(xiàn)大量細(xì)胞核碎片，表明細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被破壞.

圖3 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞核形態(tài)的影響(Bar=20 μm×250)

2.4 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖4 可見:對(duì)照組和陰性對(duì)照組(A，B)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，伸展性好，貼壁牢固，細(xì)胞表面微絨毛豐富;陽(yáng)性對(duì)照組(C)細(xì)胞皺縮，呈圓形，細(xì)胞表面微絨毛消失，出現(xiàn)泡狀突起;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細(xì)胞形狀不規(guī)則，貼壁性差，表面微絨毛消失，出現(xiàn)膜泡;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜崩解，開始從細(xì)胞表面往下脫落;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細(xì)胞明顯皺縮，表面出現(xiàn)大量的孔洞，表明細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)已被破壞.

圖4 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的影響

2.5 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的影響

從圖5 可見:對(duì)照組和陰性對(duì)照組(A，B)細(xì)胞膜完整，表面微絨毛豐富，細(xì)胞器分布均勻，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯;陽(yáng)性對(duì)照組(C)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜被破壞，核物質(zhì)致密呈斑塊狀，出現(xiàn)凋亡小體;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細(xì)胞表面微絨毛消失，細(xì)胞膜被破壞，染色質(zhì)凝集，有凋亡小體出現(xiàn);400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)容物與細(xì)胞器外泄，染色體斷裂，呈無(wú)規(guī)律細(xì)沙狀;800 μg/mL佛手葉揮發(fā)油組(F)細(xì)胞溶脹，內(nèi)容物大量外泄，細(xì)胞空泡化，表明細(xì)胞已經(jīng)壞死.

圖5 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的影響(Bar=1 μm)

2.6 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞微管分布的影響

佛手葉揮發(fā)油作用于HeLa 癌細(xì)胞24 h 后，用免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的整體形態(tài)與微管分布，結(jié)果如圖6 所示:對(duì)照組和陰性對(duì)照組(A，B)微管連貫性強(qiáng)，呈清晰絲狀結(jié)構(gòu)，圍繞在細(xì)胞核周圍，均勻分布于整個(gè)細(xì)胞中;陽(yáng)性對(duì)照組(C)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞表面出現(xiàn)泡狀突起，微管被破壞;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細(xì)胞呈圓形，微管遭到一定程度的破壞，呈模糊狀，與陽(yáng)性對(duì)照類似;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細(xì)胞呈球形，微管遭到破壞，內(nèi)容物開始外泄;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細(xì)胞溶脹裂解，形態(tài)不規(guī)則，微管破壞后大量外泄.

圖6 佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞微管纖維結(jié)構(gòu)與分布的影響(Bar=5 μm)

3 討論

細(xì)胞死亡的主要方式包括細(xì)胞凋亡和壞死.目前細(xì)胞凋亡與壞死的檢測(cè)方法有很多種，但形態(tài)觀察仍然是檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死的可靠手段.細(xì)胞凋亡時(shí)主要表現(xiàn)為:細(xì)胞萎縮，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集化，出現(xiàn)凋亡小體等特征.細(xì)胞壞死時(shí)表現(xiàn)為:細(xì)胞溶脹，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞器和內(nèi)含物大量外泄，細(xì)胞空泡化.

本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的佛手葉揮發(fā)油分別處理HeLa 癌細(xì)胞6，12 和24 h 后，噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa 細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性.低劑量(200 μg/mL)佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 細(xì)胞24 h 后，倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，成團(tuán)聚集;Hoechst 33342/PI 染色結(jié)果顯示細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集邊緣化，呈亮藍(lán)色熒光塊狀顆粒;而中、高劑量(400，800 μg/mL)佛手葉揮發(fā)油處理后，細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片，細(xì)胞核破碎.此結(jié)果與呂學(xué)維等［11］的研究結(jié)果一致.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn):佛手葉揮發(fā)油低劑量組細(xì)胞表面微絨毛消失，出現(xiàn)膜泡;而高劑量組細(xì)胞萎縮，細(xì)胞膜崩解，與麻艷芳等［7］描述的結(jié)果相對(duì)應(yīng).透射電鏡觀察結(jié)果顯示:佛手葉揮發(fā)油低劑量組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝集邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體等特征，與文獻(xiàn)［12-13］中報(bào)道的細(xì)胞凋亡特征類似;而中、高劑量組細(xì)胞染色質(zhì)斷裂呈細(xì)沙狀，內(nèi)容物大量外泄，細(xì)胞空泡化，可能是佛手葉揮發(fā)油作為脂溶性物質(zhì)破壞了細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)造成的.此外，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細(xì)胞24 h 后，微管受到不同程度的破壞，隨著藥物劑量的增大，微管纖維破壞程度更加嚴(yán)重，結(jié)果與曹波等［14］的研究結(jié)果類似.

綜上所述，佛手葉揮發(fā)油能夠抑制HeLa 癌細(xì)胞的增殖，低劑量佛手葉揮發(fā)油能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而中、高劑量的佛手葉揮發(fā)油能夠?qū)е录?xì)胞壞死.

［1］王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應(yīng)用［M］.2 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:557-559.

［2］Menichini F，Tundis R，Bonesi M，et al.Chemical composition and bioactivity of Citrus medica L.cv.Diamante essential oil obtained by hydrodistillation，cold-pressing and supercritical carbon dioxide extraction［J］.Nat Prod Res，2011，25(8):789-799.

［3］Marie-Laure L，Dominique de R S，F(xiàn)elix T，et al.Chemical composition of peel and leaf essential oils of Citrus medica L.and C.limonimedica Lush［J］.Flavour and Fragrance Journal，1999，14(3):161-166.

［4］邵鄰相，趙鐵軍.佛手提取液對(duì)小鼠皮膚膠原蛋白含量影響的研究［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2003，33(3):157-158.

［5］徐曉紅，金曉玲，章子貴.金華佛手醇提液對(duì)小鼠記憶、耐力和免疫機(jī)能的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，23(2):180-183.

［6］邵鄰相，呂學(xué)維，鄧剛，等.佛手揮發(fā)油對(duì)B16 細(xì)胞增殖及其酪氨酸酶活性的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，34(2):202-206.

［7］麻艷芳，邵鄰相，張均平，等.佛手揮發(fā)油對(duì)MDA-MB-435 人乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(22):1737-1741.

［8］Essien E P，Essien J P，Ita B N，et al.Physicochemical properties and fungitoxicity of the essential oil of Citrus medica L.against groundunt storage fungi［J］.Turk J Bot，2008，32:161-164.

［9］郭衛(wèi)東，鄭建樹，鄧剛，等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(8):103-107.

［10］Pultrini A de M，Galindo L A，Costa M.Effects of the essential oil from Citrus aurantium L.in experimental anxiety models in mice［J］.Life Sci，2006，78(15):1720-1725.

［11］呂學(xué)維，邵鄰相，張均平，等.佛手揮發(fā)油對(duì)B16 黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26(8):50-53.

［12］于秀艷，曾常茜，高松，等.透骨草提取物誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制研究［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28(7):608-610.

［13］Li Yang，Liu Ying，F(xiàn)u Yujian，et al.The trigggering of apoptosis in macrophages by pristine graphene through the MAPK and TGF-beta signaling pathways［J］.Biomaterials，2012，33(2):402-411.

［14］曹波，雷志勇，陳虹，等.新的微管抑制劑YB-13 誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(8):50-53.