付 偉，嚴(yán) 旭，王 超，潘建偉

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

生長(zhǎng)素(auxin)是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的植物激素之一，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸(polar auxin transport，PAT)是所有已知植物激素特有的一種運(yùn)輸方式，在植物胚胎、側(cè)生器官的發(fā)生與發(fā)育、向性生長(zhǎng)(tropism)中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用［1-3］，已成為植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)之一.生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸是由質(zhì)膜定位的輸入載體AUX1/LAX 家屬(auxin resistant 1/like AUX1 family)［4］、輸出載體ABC(ATP-binding cassette transporters，multidrug resistance/p-glycoproteins，MDR/PGP)［5］和PIN 家屬(PINFORMED family)［6］協(xié)同完成的，其中PIN 蛋白在質(zhì)膜上的極性定位在很大程度上決定了生長(zhǎng)素的極性流向和梯度分布［7-8］，而生長(zhǎng)素通過(guò)抑制PIN 蛋白的內(nèi)吞(endocytosis)促進(jìn)自身的極性輸出［9-10］.生長(zhǎng)素的不對(duì)稱分布在植物胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、向性生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用［11-14］.然而，生長(zhǎng)素調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞的分子機(jī)理仍不是十分清楚.如:生長(zhǎng)素是組成型地抑制PIN 蛋白內(nèi)吞，還是僅僅瞬時(shí)抑制其內(nèi)吞?目前還沒(méi)有明確的定論.

擬南芥PIN2 主要在根尖表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸精細(xì)調(diào)控植物根尖的向地性(gravitropism)生長(zhǎng)和在土壤中的生長(zhǎng)方向［14-15］.因此，深入研究生長(zhǎng)素調(diào)控PIN2 的質(zhì)膜定位、胞內(nèi)運(yùn)輸(intracellular trafficking)和降解，對(duì)正確理解植物根的向地性生長(zhǎng)和根系發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義.本研究主要觀察了外源生長(zhǎng)素長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)擬南芥質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響，以及外源生長(zhǎng)素調(diào)控PIN2-GFP 內(nèi)吞、胞內(nèi)運(yùn)輸及其降解的情況.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與生長(zhǎng)條件

本研究所用野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)為Col-0(Columbia-0)，分子標(biāo)記PIN2∶∶PIN2∶GFP轉(zhuǎn)基因植株［16］和生長(zhǎng)素受體四突變體tir1-1afb1-1afb2-1afb3-1(tir1afb1，2，3)［17］分別由Ben Scheres 和Mark Estelle 實(shí)驗(yàn)室提供.將PIN2∶∶PIN2∶GFP 與tir1afb1，2，3 四突變體雜交，根據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)熒光、突變體表型和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定結(jié)果，獲得PIN2∶∶PIN2∶GFP tir1afb1，2，3 純合株系［10］.

擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，在4 ℃黑暗處理3 d，然后在含1.5%瓊脂1/2MS(Sigma 公司)培養(yǎng)基表面萌發(fā)，培養(yǎng)皿豎直放置.生長(zhǎng)條件為:24 ℃16 h 光照/22 ℃8 h 黑暗，70%～80%相對(duì)濕度和6 000 lx光照強(qiáng)度.萌發(fā)5 d 后的幼苗根用于本研究的所有實(shí)驗(yàn).對(duì)于四突變體，挑選生長(zhǎng)相對(duì)較好的四突變體幼苗根用于實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

本研究所用的生長(zhǎng)素IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)，1-NAA(1-萘乙酸，naphthalene-1-acetic acid)，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxy acetic acid)和液泡H+-ATPase 抑制劑ConA(Concanamycin)等均購(gòu)自Sigma 公司.氰化鉀(KCN)由本學(xué)院藥品保管室提供.

生長(zhǎng)素母液配制:將IAA，1-NAA 和2，4-D 首先用幾滴1 mol/L KOH 溶液溶解，再用去離子水稀釋到10 mmol/L，過(guò)濾滅菌后分裝保存于－20 ℃?zhèn)溆茫?0，18］.本研究所用的生長(zhǎng)素工作濃度均為10 μmol/L.

ConA 用二甲基亞砜(DMSO)溶解，母液濃度為10 mmol/L，工作濃度為5 μmol/L.

實(shí)驗(yàn)具體方法如下:在正常室溫和光照條件下，1)將萌發(fā)5 d 的幼苗在含有外源生長(zhǎng)素的1/2MS液體培養(yǎng)基中處理8 h;2)將萌發(fā)5 d 的幼苗分別在4 ℃1/2MS 液體培養(yǎng)基和含有1 mmol/L KCN 的1/2MS液體培養(yǎng)基中預(yù)處理0.5 h，再加入2，4-D 處理8 h;3)將萌發(fā)5 d 的幼苗在5 μmol/L ConA 液體培養(yǎng)基中預(yù)處理0.5 h，再加入2，4-D 處理8 h.上述處理結(jié)束后，用新的1/2MS 液體培養(yǎng)基快速漂洗2 次，激光共聚焦顯微鏡掃描根尖表皮細(xì)胞.

1.3 激光共聚焦顯微分析和數(shù)據(jù)處理

本研究所使用的激光共聚焦顯微鏡型號(hào)為L(zhǎng)eica TCS SP5 AOBS，用于GFP 熒光觀察的激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510 nm.所有實(shí)驗(yàn)均在相同設(shè)置下完成，并獨(dú)立重復(fù)3 次.用Image J 軟件對(duì)PIN2-GFP 質(zhì)膜信號(hào)或胞內(nèi)總信號(hào)進(jìn)行定量分析，用胞內(nèi)總信號(hào)表示液胞內(nèi)的PIN2-GFP 積累.定量結(jié)果用t-檢驗(yàn)(雙尾)進(jìn)行顯著性差異分析，并將對(duì)照處理組的PIN2-GFP 信號(hào)強(qiáng)度表示為100%.

2 結(jié)果

2.1 外源生長(zhǎng)素對(duì)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響

已有研究表明，外源生長(zhǎng)素短時(shí)間(2 h)處理野生型擬南芥(Col-0)根尖，能快速抑制根尖表皮細(xì)胞PIN2 內(nèi)吞，從而促進(jìn)質(zhì)膜PIN2 豐度和生長(zhǎng)素的極性輸出［9-10］.然而，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，用外源生長(zhǎng)素2，4-D處理不同時(shí)間(0，2，4，6 和8 h)，發(fā)現(xiàn)8 h 處理后，與對(duì)照相比，根尖質(zhì)膜PIN2-GFP 信號(hào)顯著性下降(圖略).因此，本研究用不同的外源生長(zhǎng)素IAA，1-NAA 和2，4-D 分別處理8 h 后，發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜PIN2-GFP 信號(hào)均明顯下降(見圖1(a)).定量分析結(jié)果表明，與對(duì)照處理相比，外源生長(zhǎng)素處理均顯著性下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 的豐度(t-檢驗(yàn)，P ＜0.000 1.見圖1(b)).這一結(jié)果暗示，外源生長(zhǎng)素長(zhǎng)時(shí)間處理可促進(jìn)PIN2-GFP 內(nèi)吞，從而下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 的豐度.

圖1 外源生長(zhǎng)素處理8 h 對(duì)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響

2.2 低溫和KCN 抑制生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

圖2 低溫和KCN 抑制外源生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

已有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)吞需要消耗腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，低溫和KCN 通過(guò)抑制ATP 的產(chǎn)生而有效地阻礙細(xì)胞膜蛋白的內(nèi)吞［19］.如果外源生長(zhǎng)素誘導(dǎo)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)是通過(guò)內(nèi)吞途徑，預(yù)期低溫和KCN 能抑制生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的PIN2-GFP 豐度下調(diào).實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示，與對(duì)照處理相比，低溫和KCN 顯著性抑制了2，4-D 誘導(dǎo)的PIN2-GFP 豐度下調(diào)(t-檢驗(yàn)，P ＜0.01 和P ＜0.001.見圖2(b)).同樣，低溫和KCN 也能顯著抑制IAA 或1-NAA 誘導(dǎo)的PIN2-GFP 豐度下調(diào)(圖略).這些結(jié)果表明，外源生長(zhǎng)素誘導(dǎo)質(zhì)膜PIN2-GFP 水平下調(diào)是通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)吞途徑.從激光共聚焦顯微鏡觀察和定量分析結(jié)果看，低溫抑制質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)的程度明顯高于KCN 的抑制效果(見圖2(b))，這可能是由于KCN的工作濃度不是最佳濃度.

2.3 TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

已知生長(zhǎng)素通過(guò)其受體TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑調(diào)控下游基因的表達(dá).最近的研究表明，TIR1/AFB介導(dǎo)的信號(hào)途徑參與調(diào)控PIN2 蛋白的內(nèi)吞或與胞內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)［10，20］.因此，為進(jìn)一步研究外源生長(zhǎng)素是否通過(guò)其受體TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)，將PIN2∶∶PIN2-GFP分子標(biāo)記與生長(zhǎng)素受體四突變體tir1afb1，2，3 雜交，獲得PIN2∶∶PIN2-GFPtir1afb1，2，3 純合株系.用外源生長(zhǎng)素2，4-D 分別處理野生型PIN2∶∶PIN2-GFP 和四突變體PIN2∶∶PIN2-GFP 純合株系幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在沒(méi)有外源生長(zhǎng)素的情況下，tir1afb1，2，3 四突變體的質(zhì)膜PIN2-GFP 水平顯著性高于野生型擬南芥(t-檢驗(yàn)，P ＜0.01.見圖3 中A 和C);在外源生長(zhǎng)素2，4-D 存在的情況下，2，4-D 顯著性地誘導(dǎo)了野生型擬南芥質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的下調(diào)(t-檢驗(yàn)，P ＜0.001)，但未能有效誘導(dǎo)tir1afb1，2，3 四突變體質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的下調(diào)(t-檢驗(yàn)，P ＞0.05.見圖3 中B 和D).這些結(jié)果表明，外源生長(zhǎng)素通過(guò)TIR1/AFB介導(dǎo)的信號(hào)途徑調(diào)控質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度，生長(zhǎng)素受體TIR1/AFB 突變促進(jìn)PIN2-GFP 質(zhì)膜定位.

圖3 外源生長(zhǎng)素通過(guò)TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度

2.4 生長(zhǎng)素促進(jìn)PIN2-GFP 在液泡中降解

已知質(zhì)膜定位的PIN2-GFP 經(jīng)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，一部分PIN2-GFP 通過(guò)再循環(huán)途徑又回到質(zhì)膜，其余的PIN2-GFP 則被運(yùn)輸?shù)揭号輧?nèi)降解［18，21］.本研究結(jié)果已經(jīng)表明，在無(wú)外源生長(zhǎng)素的情況下，四突變體的胞內(nèi)PIN2-GFP 信號(hào)明顯強(qiáng)于野生型，暗示生長(zhǎng)素受體TIR1/AFB 突變后很可能影響了PIN2-GFP 的胞內(nèi)運(yùn)輸或液泡內(nèi)降解.

在光照條件下，PIN2-GFP 蛋白進(jìn)入液泡后迅速被降解，因此很難觀察到PIN2-GFP 在液泡內(nèi)的積累［21］.利用液泡H+-ATPase 抑制劑ConA 能有效地抑制液泡的降解功能［22］，可用來(lái)分析PIN2-GFP 在液泡內(nèi)的積累水平.如圖4 所示:用ConA 處理野生型和四突變體幼苗，可明顯地看到大小不同的液泡內(nèi)均有PIN2-GFP 的積累(見圖4 中A，B，D 和E);在野生型擬南芥中，能觀察到外源生長(zhǎng)素2，4-D 明顯地促進(jìn)了PIN2-GFP 在液泡中的積累(見圖4 中B 和C)，但在四突變體中未能觀察到這種促進(jìn)效應(yīng)(見圖4 中E 和F);進(jìn)一步地定量統(tǒng)計(jì)分析表明，2，4-D 能顯著性地促進(jìn)野生型擬南芥PIN2-GFP 的液泡積累(t-檢驗(yàn)，P ＜0.01)，但在四突變體中沒(méi)有顯著性差異(t-檢驗(yàn)，P ＞0.05)(見圖4(b)).這一結(jié)果暗示，外源生長(zhǎng)素通過(guò)TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑促進(jìn)PIN2-GFP 在液泡中的降解.

圖4 外源生長(zhǎng)素促進(jìn)PIN2-GFP 在液泡中積累

3 討論

本研究結(jié)果表明，外源生長(zhǎng)素通過(guò)TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑調(diào)控生長(zhǎng)素輸出載體PIN2-GFP 的質(zhì)膜豐度、內(nèi)吞、胞內(nèi)運(yùn)輸和降解.這一結(jié)果與文獻(xiàn)［20］的報(bào)道基本一致，但似乎與外源生長(zhǎng)素抑制PIN2-GFP 內(nèi)吞的報(bào)道［9-10］相矛盾.這有2 種可能:1)外源生長(zhǎng)素短時(shí)間(2 h)處理與長(zhǎng)時(shí)間(8 h)處理可能啟動(dòng)了植物細(xì)胞的不同響應(yīng)機(jī)制，表現(xiàn)為外源生長(zhǎng)素在不同時(shí)間段有不同的生物學(xué)功能，如早期抑制內(nèi)吞和后期促進(jìn)內(nèi)吞2 個(gè)截然不同的調(diào)控機(jī)制;2)外源生長(zhǎng)素早期抑制PIN2 內(nèi)吞，但到后期可能激活了與原先不同的內(nèi)吞途徑，從而通過(guò)別的內(nèi)吞途徑促進(jìn)PIN2 的內(nèi)吞、胞內(nèi)運(yùn)輸和降解.但這些假設(shè)仍需要用進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明.

絕大部分植物質(zhì)膜蛋白經(jīng)內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞內(nèi)，然后再通過(guò)胞內(nèi)運(yùn)輸途徑輸送到液泡內(nèi)進(jìn)行降解［18］.本研究結(jié)果證明了外源生長(zhǎng)素通過(guò)TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)，促進(jìn)PIN2-GFP 在液泡內(nèi)積累與降解，但目前仍然不清楚TIR1/AFB 介導(dǎo)的信號(hào)途徑的具體作用位點(diǎn)，即從內(nèi)吞到液泡膜、從液泡膜到液泡腔、或兩者兼而有之?因此，仍需要進(jìn)一步的分子證據(jù)來(lái)證明這些細(xì)節(jié).

［1］Benková E，Michniewicz M，Sauer M，et al.Local，efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation［J］.Cell，2003，115(5):591-602.

［2］Wan Yinglang，Jasik J，Wang Li，et al.The signal transducer NPH3 integrates the phototropin1 photosensor with PIN2-based polar auxin transport in Arabidopsis root phototropism［J］.Plant Cell，2012，24(2):551-565.

［3］Ding Zhaojun，Galván-Ampudia C S，Demarsy E，et al.Light-mediated polarization of the PIN3 auxin transporter for the phototropic response in Arabidopsis［J］.Nature Cell Biology，2011，13(4):447-452.

［4］Swarup K，Benková E，Swarup R，et al.The auxin influx carrier LAX3 promotes lateral root emergence［J］.Nature Cell Biology，2008，10(8):946-954.

［5］Titapiwatanakun B，Blakeslee J J，Bandyopadhyay A，et al.ABCB19/PGP19 stabilises PIN1 in membrane microdomains in Arabidopsis［J］.Plant J，2009，57(1):27-44.

［6］Petrásek J，Mravec J，Bouchard R，et al.PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux［J］.Science，2006，312(5775):914-918.

［7］Wisniewska J，Xu Jian，Seifertová D，et al.Polar PIN localization directs auxin flow in plants［J］.Science，2006，312(5775):883.

［8］Grieneisen V A，Xu Jian，Maree A F，et al.Auxin transport is sufficient to generate a maximum and gradient guiding root growth［J］.Nature，2007，449(7165):1008-1013.

［9］Paciorek T，Zazímalová E，Ruthardt N，et al.Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells［J］.Nature，2005，435(7046):1251-1256.

［10］Pan Jianwei，F(xiàn)ujioka S，Peng Jiangling，et al.The E3 ubiquitin ligase SCF TIR1/AFB and membrane sterols play key roles in auxin regulation of endocytosis，recycling，and plasma membrane accumulation of the auxin efflux transporter PIN2 in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Cell，2009，21(2):568-580.

［11］Friml J，Wisniewska J，Benková E，et al.Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis［J］.Nature，2002，415(6873):806-809.

［12］Friml J，Vieten A，Sauer M，et al.Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis［J］.Nature，2003，426(6963):147-153.

［13］Blilou I，Xu Jian，Wildwater M，et al.The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots［J］.Nature，2005，433(7021):39-44.

［14］Abas L，Benjamins R，Malenica N，et al.Intracellular trafficking and proteolysis of the Arabidopsis auxin-efflux facilitator PIN2 are involved in root gravitropism［J］.Nature Cell Biology，2006，8(3):249-256.

［15］潘建偉，葉曉帆，王超，等.擬南芥PIN2 介導(dǎo)的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸調(diào)控植物根向地性［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，33(1):1-6.

［16］Xu Jian，Scheres B.Dissection of Arabidopsis ADP-RIBOSYLATION FACTOR 1 functions in epidermal cell polarity［J］.Plant Cell，2005，17(2):525-536.

［17］Dharmasiri N，Dharmasiri S，Estelle M.The F-box protein TIR1 is an auxin receptor［J］.Nature，2005，435(7041):441-445.

［18］Wang Chao，Yan Xu，Chen Qian，et al.Clathrin light chains regulate clathrin-mediated trafficking，auxin signaling，and development in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2013，25(2):499-516.

［19］Horn M A，Heinstein P F，Low P S.Receptor-mediated endocytosis in plant cells［J］.Plant Cell，1989，1(10):1003-1009.

［20］Baster P，Robert S，Kleine-Vehn J，et al.SCFTIR1/AFB-auxin signalling regulates PIN vacuolar trafficking and auxin fluxes during root gravitropism［J］.EMBO J，2012，32(2):260-274.

［21］Laxmi A，Pan Jianwei，Morsy M，et al.Light plays an essential role in intracellular distribution of auxin efflux carrier PIN2 in Arabidopsis thaliana［J］.PLoS ONE，2008，3(1):e1510.

［22］Matsuoka K，Higuchi T，Maeshima M，et al.A vacuolar-type H+-ATPase in a nonvacuolar organelle is required for the sorting of soluble vacuolar protein precursors in tobacco cells［J］.Plant Cell，1997，9(4):533-546.