王天寶 石漢平 韓方海 董文廣

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約每年增加4%。CRC治療失敗的主要原因是深層浸潤、淋巴和遠處轉(zhuǎn)移等，約30%～60%患者初次就診時就存在局部或遠處轉(zhuǎn)移灶，而根治性切除術(shù)后5年內(nèi)，約50%患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，即使完整切除復(fù)發(fā)灶，仍約有60% ～70%患者再次復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［1］。CRC浸潤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，包括:細胞黏附性能改變、細胞基質(zhì)降解、腫瘤細胞局部浸潤、腫瘤細胞循環(huán)內(nèi)播散、免疫逃逸、血管內(nèi)腫瘤細胞栓塞形成及在新的微環(huán)境中重新生長等。在此過程中，腫瘤細胞需要首先克服失巢凋亡、機體免疫及各種治療殺傷等致命威脅才能在新的微環(huán)境中形成轉(zhuǎn)移灶［2］。細胞自噬是進化上高度保守、受自噬相關(guān)基因和復(fù)雜信號通路調(diào)控的一種自我消化過程［3］。研究發(fā)現(xiàn)自噬可以協(xié)助乳腺癌細胞克服失巢凋亡［4］。在Earle平衡鹽溶液(Earlebalancedsaltsolution，EBSS)中培養(yǎng)的營養(yǎng)缺乏情況下，結(jié)直腸癌細胞自噬體明顯增加，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)則顯著促進細胞凋亡，但在腫瘤鄰近組織上皮細胞則未見此現(xiàn)象［5］。脂聯(lián)素可增加結(jié)腸癌細胞微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubuleassociatedproteinlightchain 3，LC3)濃度，抑制自噬相關(guān)基因 mTOR及 Akt表達，從而促進自噬，確保細胞在營養(yǎng)缺乏條件下生存［6］?？傊毎允煽赡芘c結(jié)直腸癌發(fā)生、增殖和凋亡有關(guān)。然而腫瘤細胞在浸潤轉(zhuǎn)移途中必須克服各種致命威脅因素，在此過程中，細胞自噬可能也扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞自噬增強促進細胞遷移和浸潤，可能是惡性腫瘤局部和遠處轉(zhuǎn)移的機制之一。

材料與方法

一、材料

胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、GAPDH內(nèi)參抗體和磷酸鉀緩沖液(phosphate bufferedsaline，PBS)(hyclone)，3-MA，Lovo 結(jié)腸癌細胞株(上海市腫瘤研究所)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Westernblot試劑盒(武漢博士德公司)，pSELECT-GFP-LC3及定量 PCR用的 SYBR GreenqPCRSuperMix(Invitrogen)，LipofectamineTM2000、Transwell細胞培養(yǎng)板及 Matrigel膠(BD)，ABI PRISM7500SequenceDetectionSystem，日立-7650透視電子顯微鏡，倒置光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，細胞恒溫培養(yǎng)箱(美國 thermoscientific公司)，倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

二、方法

1．細胞復(fù)蘇與培養(yǎng):按常規(guī)復(fù)蘇Lovo細胞。將水浴鍋預(yù)熱至37℃。75%酒精擦拭，紫外線照射超凈工作臺30min。取出細胞培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，吸掉舊培養(yǎng)液。用PBS洗滌細胞1～2次。加入Trypsin-EDTA溶液2ml/75cm2，輕洗細胞皿底部。吸掉Trypsin-EDTA溶液，放入37℃培養(yǎng)箱2～3min，輕拍培養(yǎng)瓶壁使大部分細胞脫落，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，加入適量含血清的新鮮培養(yǎng)基終止Trypsin作用。以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，MEM培養(yǎng)基補足樣本量3瓶傳代細胞，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。放入 CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，飽和濕度，37℃)。

2．細胞轉(zhuǎn)染pSELECT-GFP-LC3質(zhì)粒:轉(zhuǎn)染前一天對細胞進行傳代，使其匯合度為60% ～70%，質(zhì)粒的濃度為1．6～2．0μg/ml。6孔培養(yǎng)板，每孔表面積10cm2，培養(yǎng)基用量為2000μl。吸取質(zhì)粒母液(0．5 μg/μl)3．2 μl溶解到1000 μlOpti-MEM 培養(yǎng)基為 A液;取10μlLipofectamineTM2000溶解于1000μlOpti-MEM培養(yǎng)基為B液;B液混合5min后，將A液和B液混合，靜止20min后加到細胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染4h后換為含10%FBS的MEM培養(yǎng)基。

3．實驗分組及激光共聚焦顯微鏡觀察:自噬自強組:細胞轉(zhuǎn)染pSELECT-GFP-LC3后，用PBS洗三次，單獨用 EBSS培養(yǎng) 3h。自噬抑制組:250μmol/L3-MA處理Lovo細胞3h。正常Lovo細胞自噬組:正常培養(yǎng)3h。于六孔板中，將Lovo細胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片，4h后收獲細胞，4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS洗兩次，加入 0．25%Triton-X100，冰上放置 5min，PBS 洗2次，然后加入1%牛血清白蛋白處理30min，加入1%BSA稀釋的兔抗人LC3(1∶100)，4℃孵育過夜。次日細胞用PBS洗3次后，加入FITC標記的羊抗兔IgG(1%BSA以1∶20的比例稀釋)，室溫下避光孵育30min，PBS再次洗滌細胞后，用10μg/mlPI和0．1%RNaseA室溫下細胞核DNA染色30min，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍片，綠色熒光顆粒數(shù)代表細胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量，提示自噬狀態(tài)。

4．Q-PCR檢測:參照RNA提取試劑盒操作手冊提取總RNA，檢測其完整性。在RNasefree的PCR管中，將提取的總1．0μgRNA加入雙蒸水中，總體積12μl。將上述溶液吹打均勻，將溫度設(shè)置為65℃保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復(fù)性。在該PCR管中再加入下列試劑:Oligo(dT)Randomprimer0．5 μl，10 μmol/L dNTP2．0 μl，RNaseinhibitor0．5 μl，5 × buffer 4．0 μl，M-MLV0．5 μl。將上述 20 μl反應(yīng)溶液30℃保溫10min。42℃保溫60min。80℃保溫10min。內(nèi)參片段:18SrRNA-112bp(F:CCTGGATA CCGCAGCTAGGA，R:GCGGCGCAATACGAATGCCCC)。目的片段:Beclin1-151bp(F:AAGGCGAGACACG TTTTTG，R:TTCGTCAGCATGAACTTGAG)。反應(yīng)體系:cDNA5．0 μl，上游引物 0．5 μl，下游引物0．5 μl，2 × SYBRGreenqPCRSuperMix10．0 μl，dH2O4．0 μl。經(jīng) 95 ℃ 2min，50 ℃ 2min，95 ℃15s，60℃ 32s循環(huán)后讀板，40cycles;融解曲線分析溫度60～95℃。每個樣重復(fù)3次。

5．電鏡檢測:細胞離心為細胞團，在4℃冰箱內(nèi)進行以下實驗:2．5%戊二醛磷酸緩沖液固定2h。用0．1mol/L磷酸漂洗液漂洗15min，進行三次。1%鋨酸固定液固定，2～3h。用0．1mol/L磷酸漂洗液漂洗15min，進行3次。脫水:50%乙醇，15～20min;70%乙醇，15～20min;90%乙醇，15～20min;90%乙醇90%丙酮(1∶1)，15 ～20min;90%丙酮，15 ～20min。100%丙酮，室溫，15 ～20min，進行3次。包埋:純丙酮 +包埋液(2∶1)，室溫3～4h;純丙酮+包埋液(1∶2)，室溫，過夜;純包埋液，37℃，2～3h。固化:37℃烘箱，過夜;45℃烘箱，12h;60℃烘箱，24h。超薄切片機切片，厚度50～60nm。3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察拍片。

6．Transwell檢測不同自噬狀態(tài)對細胞遷移與侵襲能力的影響:計數(shù)1×105個正常Lovo細胞、自噬增強組及自噬抑制組細胞，用100μl無血清1640培養(yǎng)基重懸，加入Transwell上室，在下室加入600μl完全培養(yǎng)基。37℃，5%CO2孵育，在24h及48h分別取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌一次，結(jié)晶紫染色10min，PBS洗滌一次，檢測細胞是否穿過小孔，如有穿過終止其他實驗組，并拍照計數(shù)，評價對遷移能力的影響。Matrigel模仿細胞外基質(zhì)，4℃溶解過夜，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1∶3的體積比稀釋Matrigel，取40μl加入預(yù)冷的Transwell小室中，37℃孵育2h使Matrigel凝固。吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100μl、600μl無血清培養(yǎng)基，37℃過夜。采用上述遷移檢測方法評價對侵襲能力的影響。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS10．5統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．激光共聚焦顯微鏡觀察:綠色熒光顆粒以自噬增強組最多，其次為正常細胞組，而3-MA自噬抑制組最少(圖1)。

2．Q-PCR檢測:Beclin1mRNA表達量自噬增強組為(1．23 ±0．12)個，正常細胞組為(1 ±0．13)個，3-MA 自噬抑制組為(0．98±0．1)個。

3．透視電鏡:自噬增強組見大量的自噬溶酶體，明顯多于正常細胞組和3-MA自噬抑制組(圖2)。

4．Transwell實驗:遷移實驗細胞計數(shù)自噬增強組為(138．0 ±16．7)個，高于正常細胞組(90．7 ±12．9)個(P=0．026)和自噬抑制組(92．7 ±26．7)個(P=0．030)，正常細胞組和自噬抑制組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．905)。侵襲實驗細胞計數(shù)自噬增強組為(147．0±13．0)個，高于正常細胞組(99．0 ±20．5)個(P=0．028)和自噬抑制組(95．7 ±25．6)個(P=0．021)，正常細胞組和自噬抑制組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．848)。

討 論

圖1 激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察自噬增強組、正常細胞組和自噬抑制組Lovo細胞內(nèi)熒光顆粒圖像

圖2 透視電鏡下觀察自噬增強組細胞、正常細胞組和3-MA自噬抑制組Lovo細胞的自噬溶酶體圖像

細胞自噬本質(zhì)是細胞內(nèi)的一些雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分自噬底物，如老化或損傷的細胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)等胞質(zhì)成分形成自噬體，隨后轉(zhuǎn)運至溶酶體并與之融合形成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)蛋白水解酶消化降解底物后，生成氨基酸或游離脂肪酸，從而使營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)利用［7］。多數(shù)研究證實，細胞自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，既可以作為抑制腫瘤發(fā)生的一種機制，也是在代謝應(yīng)激等不利生存環(huán)境下的一種腫瘤保護機制。本研究證實營養(yǎng)缺乏可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬溶酶體和LC3-GFP熒光顆粒數(shù)量明顯增加，證實自噬水平升高。自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達自噬增強組也高于正常細胞組和自噬抑制劑組。在正常結(jié)直腸粘膜腺體可見細胞自噬激活，而且多見于未分化的祖細胞群，據(jù)此推測細胞自噬參與結(jié)直腸癌的發(fā)生［8］，LC3高表達與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后較差有關(guān)［9］。結(jié)腸癌細胞株HT-29自噬相關(guān)死亡的細胞內(nèi)見大量自噬體、LC3及酸性囊泡結(jié)構(gòu)［10］。在長時間饑餓條件下，結(jié)直腸癌細胞株HCT116細胞內(nèi)野生型P53抑制LC3和自噬流;但在P53缺失情況下，LC3則會大量積聚，過度自噬導(dǎo)致細胞死亡［11］。采用RNAi技術(shù)沉默自噬蛋白Atg7可明顯抑制5-氟尿嘧啶耐藥結(jié)腸癌細胞株細胞自噬，提高5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細胞凋亡水平［12］。自噬抑制劑二磷酸氯喹和5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用明顯抑制結(jié)腸癌BALB/c裸小鼠移植瘤生長和細胞自噬水平，提示抑制自噬可提高化療效果［13］。因此，細胞自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能具有雙重作用，既是抑制腫瘤發(fā)生的一種機制，也是在代謝應(yīng)激等不利生存環(huán)境下的一種腫瘤保護機制。

本研究證實自噬增強促進結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲。在低氧或營養(yǎng)缺乏條件下，腫瘤細胞會通過激活血管內(nèi)皮生長因子等基因的表達，促進腫瘤組織內(nèi)部血管形成，從而增加組織內(nèi)部的氧供。同時還會通過諸如激活CXCR4等基因表達以增強腫瘤細胞的侵襲和運動能力，刺激腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［14］。SDF-1/CXCR4結(jié)合后可促進G蛋白三聚體分離，形成GβGγ和Gαi，二者均可以激活下游信號通道的重要節(jié)點分子PI3K［15］。PI3K是一個復(fù)雜的大家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中PI3KⅢ是細胞自噬激活重要的啟動因子［6-7］。結(jié)合相關(guān)文獻報道，推測SDF-1/CXCR4可能通過CXCR4-PI3KⅢ信號傳導(dǎo)通路，激發(fā)細胞自噬。因存在CXCR4-PI3KⅢ細胞自噬信號傳導(dǎo)通路，進而賦予了腫瘤細胞克服其浸潤轉(zhuǎn)移途中所遇到的各種致命威脅的能力，導(dǎo)致腫瘤細胞局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移。

總之，結(jié)腸癌細胞自噬增強促進腫瘤細胞遷移和浸潤，可能是局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的機制之一，通過改變細胞自噬狀態(tài)有望成為治療惡性腫瘤的策略之一。

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