馬璟曦，羅勇，蔡敏

腦缺血損傷修復再生過程存在著兩個不同方面：神經(jīng)發(fā)生和血管生成。它們在缺血后同時被啟動，并被精密、協(xié)調、統(tǒng)一地調控。腦缺血后“神經(jīng)發(fā)生-血管生成”之間可能存在密切聯(lián)系和相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)或血管產生的神經(jīng)血管因子[1]如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)等在神經(jīng)發(fā)生和血管生成過程中相互作用，在腦缺血后協(xié)調地表達。在本課題組原有研究基礎上[2]，本研究進一步探究電針干預后大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-de-rived neurotrophic factor,BDNF)的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

健康成年雄性Wistar大鼠90只，體重250～300 g。由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(渝)20020002。

隨機分為對照組(n=6)、模型組(局灶性腦缺血再灌注，n=42)、電針組(局灶性腦缺血再灌注+電針，n=42)。后兩組局灶性腦缺血1 h后分別于2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d共7個時相點再灌注，每個時相點6只。

1.2 模型制備

模型組和電針組采用線栓法制備右側大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定，經(jīng)頸部正中切口依次暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈顱外段。在頸外動脈殘端做一環(huán)形切口，將預先處理的栓子向頸內動脈顱內方向插入17～20 mm，如遇阻力，表明線栓頭部已通過大腦中動脈起始部，停止進線，結扎。1 h后拔回線栓至頸外動脈的殘端，實現(xiàn)再灌注。模型成功的判斷標準[3]：①左側肢體疼痛回縮遲鈍或不出現(xiàn)；②行走時向左側偏倒或原地向左側旋轉；③提尾倒懸時左上肢不向前下伸；④右側出現(xiàn)Honer征。

1.3 電針刺激方法及參數(shù)

對照組和模型組不做特殊處理。電針組參照中國針灸學會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜，選取雙側合谷穴(LI 4)為電針穴位。局灶性腦缺血后45 min，電針刺激上述穴位，15 min/次。刺激參數(shù)：疏密波F1=40 Hz，F(xiàn)2=60 Hz，空載輸出電壓1.5 V。對超過1 d的時相點，每日電針1次，7 d后自然喂養(yǎng)，不做特殊處理。

1.4 VEGFR-2 mRNA檢測

本課題組前期研究提示，電針組和模型組與對照組比較，VEGF mRNA表達在12 h增加，24 h達高峰，3 d后開始下降[2]。本實驗采用反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)檢測VEGFR-2 mRNA，選擇12 h、24 h、3 d三個代表時間點來研究。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，VEGFR-2 mRNA序列號X13412。①擴增大鼠VEGFR-2 mRNA上游引物序列：5'-CAAAGCAAGTCA TCA CCAAG-3'，下游引物序列：5'-AAG CCA GAA GAT GAA TACACT C-3'，擴增片段長度為557 bp；②擴增大鼠β-actin mRNA(內參照)上游引物序列：5'-GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT-3'，下游引物序列：5'-GCG GAT GTC CAC GTCACA CT-3'，擴增片段長度為313 bp。無酶條件下準確稱取100 mg缺血腦組織，采用Trizol提取試劑盒(Invitrogen公司)提取RNA。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1μl RNA逆轉錄為cDNA，35個循環(huán)進行PCR反應，再制膠、上樣、電泳，觀察結果，運用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.5 取材

各時間點大鼠麻醉后用生理鹽水200 ml快速左心室灌注沖洗，再用4%多聚甲醛(pH 7.4的0.1 M PBS配置，加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)500 ml先快后慢灌注固定，斷頭取腦，制備石蠟切片。取相鄰的切片用于免疫組化。

1.6 BDNF免疫組化檢測

切片脫蠟至水，抗原熱修復92～98℃15 min，滴加封閉液，滴加1∶100兔多克隆BDNF抗體(Santa Cruz公司)4℃過夜，滴加SABC。DAB顯色、脫水、透明、封片。

1.7 結果判定

VEGFR-2 mRNA RT-PCR結果判定：將電泳結果用Quantity One 4.3.1系統(tǒng)掃描，測定各條帶絕對積分光密度(optical density,OD)值，結果以mRNA相對值表示。

BDNF免疫組化陽性細胞計數(shù)：在400倍視野下計數(shù)，以胞漿染成棕黃色為陽性細胞。每只動物隨機選取3張非連續(xù)切片，每張切片取10個不連續(xù)視野的均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

每組數(shù)據(jù)用(±s)表示，用SPSS 12.0軟件進行t檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 VEGFR-2 mRNA RT-PCR結果

模型組VEGFR-2 mRNA相對值從再灌注后12 h到3 d均較對照組顯著增加(P<0.001)，再灌注后24 h達到高峰，這和本課題組既往報道的VEGF mRNA[2]表達高峰基本吻合。再灌注后3 d開始下降，但仍顯著高于對照組(P<0.001)。電針組VEGFR-2 mRNA相對值從再灌注后12 h到3 d均較對照組顯著增加(P<0.001)，再灌注后24 h達到高峰。電針組再灌注后12h、24 h VEGFR-2 mRNA明顯高于模型組(P<0.01)，電針組再灌注后3 d也高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組VEGFR-2 mRNA的表達(mRNA相對值)

2.2 BDNF蛋白免疫組化

對照組：見少量BDNF蛋白表達，著色較淡，分布于大腦皮質及海馬等部位。

模型組：與對照組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達在再灌注后2 h增加(P<0.05)，12 h繼續(xù)增加(P<0.001)，再灌注后24 h達高峰(P<0.001)，14 d仍高于對照組(P<0.001)。見圖1、表2。

電針組：與對照組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達在再灌注后2 h開始顯著增加(P<0.001)，24 h達高峰(P<0.001)，直到14 d仍有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達在再灌注后2 h開始增加(P<0.05)，再灌注后24 h達高峰(P<0.01)，3 d后增加仍有顯著性差異(P<0.05)，但呈現(xiàn)增加幅度降低的趨勢。細胞漿染成棕黃色，強陽性細胞主要在缺血半球，尤其是病灶周圍，在血管內皮細胞和神經(jīng)元都有表達，分布范圍廣泛。見圖2、表2。

圖1 模型組海馬BDNF蛋白再灌注24 h時的表達(400×)

圖2 電針組海馬BDNF蛋白再灌注24 h時的表達(400×)

表2 各組BDNF蛋白陽性細胞數(shù)

3 討論

3.1 神經(jīng)血管單元[4]和神經(jīng)血管因子

卒中后神經(jīng)修復再生過程包括神經(jīng)發(fā)生、血管新生以及突觸發(fā)生和軸突生長[5]。神經(jīng)干細胞的小生境(niche)中的血管微環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生調節(jié)起至關重要的作用[6]。既往缺血性腦血管病的研究較注重神經(jīng)細胞，而對血管內皮細胞的關注相對不夠。腦缺血后神經(jīng)和血管的相互聯(lián)系作用是現(xiàn)在腦卒中研究的熱點之一。神經(jīng)血管單元[4]由神經(jīng)元-膠質細胞-血管構成，包括神經(jīng)元、星形膠質細胞、小角質細胞、血管內皮細胞、血管周細胞、基底膜以及細胞外基質。這個概念強調細胞與細胞之間、細胞與基質之間的相互作用和動態(tài)平衡，以動態(tài)的觀點全面反映缺血后的病理生理過程，為治療缺血性腦血管病開拓了新的視野。

神經(jīng)血管因子[1]和神經(jīng)血管單元有著十分密切的關系。既往實驗表明，一些經(jīng)典的血管生長因子，如VEGF[7]、血管生成素[8]等，也具有刺激神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)保護的作用。而一些傳統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如BDNF[9]等，也具有增加血管新生或引導血管出芽等作用。這些作用于神經(jīng)和血管的生長因子統(tǒng)稱為神經(jīng)血管因子。對神經(jīng)血管因子的研究可以深化對神經(jīng)血管單元的認識。神經(jīng)血管因子為神經(jīng)發(fā)生與血管生成的聯(lián)系及作用提供了可能的分子學基礎。因此，重新認識VEGF、血管生成素、BDNF等神經(jīng)血管因子在腦缺血后的神經(jīng)功能恢復中的作用十分必要。

3.2 腦缺血和神經(jīng)血管因子

研究腦缺血后VEGF、BDNF作用的文獻報道很多，但是從神經(jīng)血管因子這一新的角度切入更能深入、系統(tǒng)、全面地了解這些因子在腦缺血后修復再生中的作用。在缺血性腦血管病的臨床治療中把神經(jīng)發(fā)生和血管生成結合起來，促進神經(jīng)血管單元的協(xié)調和優(yōu)化，是今后努力的方向。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注后VEGF、血管生成素-1的表達增加[2]。本實驗發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注后VEGFR-2、BDNF不僅在缺血半暗帶表達，而且在遠離缺血區(qū)的側腦室、海馬、紋狀體等部位表達；不僅在神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質細胞表達，而且在血管內皮細胞表達。這些結果初步提示，神經(jīng)血管因子表達部位廣泛，其可能的作用途徑和機制也是多種的。

研究表明，VEGF/VEGFR系統(tǒng)[10]可能在血管新生的早期發(fā)揮關鍵性作用，是整個腦缺血后血管新生調控的中心環(huán)節(jié)。VEGFR-2是內皮細胞上VEGF的主要受體類型。VEGF通過VEGFR-2發(fā)揮強大的血管效應，包括增加微血管通透性，刺激內皮細胞增生、入侵、遷移、存活等多個方面[11]。VEGF刺激神經(jīng)發(fā)生的可能機制是[12]：①VEGF通過促進血管小生境的建立刺激神經(jīng)前體細胞的增生和分化；②VEGF通過刺激內皮細胞釋放促進神經(jīng)發(fā)生的特異性信號，如BDNF；③VEGF作為一個直接的促有絲分裂原引起神經(jīng)前體細胞增生。腦缺血后神經(jīng)母細胞表達VEGFR-2，并沿血管遷移。VEGFR-2介導的信號通路在促進腦缺血后神經(jīng)血管重塑及其聯(lián)系神經(jīng)發(fā)生和血管生成中起關鍵作用[13]。本課題組發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表達均增加。本實驗觀察到VEGFR-2 mRNA相對值從再灌注后12 h到3 d均較對照組顯著增加，再灌注后24 h達到高峰。提示局灶性腦缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表達增加可能有助于神經(jīng)血管單元的重建。

BDNF可以在腦血管內皮細胞上表達，并通過旁分泌和自分泌作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管[14]。BDNF增加錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達來促進內皮細胞抗氧化能力[15]，促進內皮細胞存活和誘導缺血組織的血管生成[16]。本實驗觀察到BDNF蛋白表達在再灌注后2 h明顯增加，24 h達高峰，14 d仍較對照組有顯著性差異。提示神經(jīng)血管因子BDNF在腦缺血后表達增加可能有助于神經(jīng)功能的恢復和血管生成。

3.3 電針和神經(jīng)血管因子

既往研究表明，電針結合經(jīng)顱磁刺激[17]和電針[18]可以促進腦缺血大鼠BDNF及mRNA表達。電針增加大鼠腦缺血再灌注后骨髓及外周血中VEGF濃度，VEGF作用于內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面的VEGFR-2，加速EPCs動員和遷移[19]。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，電針合谷穴可能通過上調血管生長因子VEGF、血管生成素-1和下調血管抑制因子的表達[2]，上調胎盤生長因子及其受體Flt-1的表達[20]來促進局灶性腦缺血再灌注后的血管新生；上調基質衍生因子(SDF)-1α的表達來促進局灶性腦缺血再灌注大鼠外周血EPCs、趨化因子受體4+(CXCR4+)細胞和骨髓EPCs數(shù)量增加[21]；并通過上調堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)來促進神經(jīng)干細胞的增殖、遷移[22]。提示電針對“神經(jīng)血管單元”具有“整體的良性調節(jié)”作用。電針能有效治療缺血性腦血管病可能與“整體調節(jié)”神經(jīng)血管因子的表達有關。本實驗觀察到，電針刺激VEGFR-2 mRNA、BDNF蛋白表達較模型組更加明顯。本實驗還發(fā)現(xiàn)電針對整個VEGF/VEGFR系統(tǒng)都有明顯激活作用。電針對腦缺血可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多層次、多途徑的調節(jié)作用，有利于全面促進整個腦缺血后的血管新生和神經(jīng)功能恢復。

目前仍有一些問題值得進一步的探索研究，如電針對神經(jīng)血管單元的整體作用起決定性作用的因素；電針對各種神經(jīng)血管因子表達的時空變化影響及它們的相互作用；它們對神經(jīng)血管單元的各種組成成分的作用。另一個值得關注的現(xiàn)象是，本實驗電針刺激最多只有7 d，但7 d以后，甚至再灌注后21 d后神經(jīng)血管因子BDNF的表達仍高于模型組，提示電針治療效果持續(xù)時間較長，作用更持久。而既往實驗對停止電針刺激后的血管生長因子的表達情況關注較少。還需要進一步觀察和研究。

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