蔡月琴 王德軍 吳 蔚 朱 亮 呂建敏 朱科燕 陳 誠 陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州310053)

液相懸浮芯片技術(shù)是一種新型、高通量的生物芯片技術(shù)，將流式細(xì)胞術(shù)、激光技術(shù)及應(yīng)用流體學(xué)等技術(shù)結(jié)合在一起，利用懸浮在液相中的分類熒光編碼微球作為檢測載體，具有高通量、速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)及檢測范圍廣等特點。近幾年來，懸浮芯片技術(shù)在免疫學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及臨床診斷檢測等方面應(yīng)用較廣泛，被喻為后基因組時代的多功能液相芯片分析平臺，是唯一被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床診斷的新型生物芯片產(chǎn)品［1］。作為生物信息學(xué)先進(jìn)的操作技術(shù)平臺，液相懸浮芯片技術(shù)在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用仍受限制。目前國內(nèi)該技術(shù)尚處于起步階段，國外已推出了商品化的可應(yīng)用于實驗動物研究的液相懸浮芯片試劑盒，但種類非常稀少，且只局限于大小鼠的檢測，其他實驗動物如實驗兔的研究，無法得到應(yīng)用［2-4］。

實驗兔是目前生物醫(yī)藥產(chǎn)品研發(fā)及醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域最常用的實驗動物之一，尤其在生物抗體制備、眼科手術(shù)研究等方面發(fā)揮著大小鼠無法比擬的優(yōu)勢［5］。血清免疫球蛋白Ig水平是反映動物機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，Ig含量的變化與疾病密切相關(guān)，其中IgG、IgM和IgA是介導(dǎo)體液免疫的主要效應(yīng)分子。本研究分別將親和純化的兔IgG、IgM和IgA偶聯(lián)至熒光編碼微球，對偶聯(lián)條件、檢測抗體濃度和Streptavidin-PE抗體濃度、抗體反應(yīng)時間等因素進(jìn)行優(yōu)化，制備兔IgG、IgM和IgA液相懸浮芯片，為建立可應(yīng)用于實驗動物研究的液相懸浮芯片檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)，對實驗動物研究和發(fā)展生物診斷試劑有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件 WHBE兔20只，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗兔生產(chǎn)基地［SCXK(浙)2009-0042］提供。飼養(yǎng)于本中心普通級實驗兔飼養(yǎng)室［SYXK(浙)2008-0116］，溫度(20±2)℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑 親和純化的IgG、IgM、IgA以及biotin標(biāo)記的IgG、IgM、IgA均購自美國Bethyl公司;Streptavidin-PE抗體購自美國Invitrogen公司;Sulfo-NHS、EDC購自美國Thermo公司;96孔濾膜反應(yīng)板購自美國Millipore公司;熒光編碼微球、Bio-Plex calibration kit和validation kit均購自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 實驗儀器 Bio-plex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);臺式冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo公司);恒溫孵育搖床(美國 Eppendorf公司);真空抽濾洗板機(jī)(美國Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 兔IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)量的優(yōu)化每一種編碼微球偶聯(lián)一種捕獲抗體，偶聯(lián)的捕獲抗體及所用微球編號，及相應(yīng)生物素化檢測抗體見表1。42號、48號和57號三種編碼微球，分別與親和純化的IgG、IgM和IgA偶聯(lián)，每種捕獲抗體設(shè)置5個偶聯(lián)量梯度(5、10、15、20 和 30 μg)。取 100 μl 42號熒光微球(1.25×106個)于進(jìn)口離心管，用ddH2O洗滌，離心去上清，微球加80 μl 0.1 mol/L NaH2PO4(pH6.2)、10 μl 50 mg/ml S-NHS 和 10 μl 50 mg/ml EDC活化緩沖液，室溫避光垂直旋轉(zhuǎn)，活化20分鐘。活化后的42號微球平均分為5份，分別與一系列濃度的IgG捕獲抗體偶聯(lián)，捕獲抗體量設(shè)置為5、10、15、20 和30 μg 5 個梯度，室溫避光垂直旋轉(zhuǎn)偶聯(lián)2小時，偶聯(lián)完畢的微球用0.05%PBST洗滌兩遍后，加1 ml 1%PBSB，室溫避光旋轉(zhuǎn)，封閉反應(yīng)30分鐘。用1%PBSB清洗微球一遍，去除上清，加入150 μl 1%PBSB懸浮微球，用血球計數(shù)器計算微球的濃度，4℃避光保存偶聯(lián)的微球，有效期1年。48號熒光微球與IgM捕獲抗體、57號熒光微球與IgA捕獲抗體的偶聯(lián)過程與上面步驟一樣，不重復(fù)描述。

1.3.2 兔IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)效率驗證和最佳捕獲抗體偶聯(lián)量的確定 取96孔濾膜反應(yīng)板，將各組不同偶聯(lián)量的微球漩渦混勻15秒，每組3個復(fù)孔，每孔加入1×104個偶聯(lián)的微球，同時設(shè)置陰性對照，稀釋Anti-goat-IgG-PE 抗體至1 μg/ml，加50 μl到測試孔中，陰性對照孔不加，將96孔板放恒溫孵育搖床，室溫500 r/min反應(yīng)30分鐘，抽濾棄去上清，0.05%PBST 洗滌 3 次，加 125 μl 1%PBSB，900 r/min振蕩3分鐘重懸微球，Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)檢測熒光值。陰性對照熒光值不得超過100熒光強(qiáng)度中位值(Median fluorescence intensity，MFI)，偶聯(lián)捕獲抗體的微球熒光值超過2000 MFI可認(rèn)為偶聯(lián)成功。每組免疫球蛋白中，選取與最高M(jìn)FI值無顯著性差異的捕獲抗體量作為最佳偶聯(lián)量。

1.3.3 檢測抗體和Streptavidin-PE抗體工作濃度的確定 在確定最佳捕獲抗體偶聯(lián)量的基礎(chǔ)上，分別優(yōu)化檢測抗體和Streptavidin-PE抗體的最佳工作濃度。將biotin標(biāo)記的IgG、IgM和IgA檢測抗體用1%PBSB 稀釋成4 個濃度組，分別為 0.2、0.5、2、5 μg/ml，Streptavidin-PE抗體用1%PBSB稀釋為1、2、5 μg/ml 3個濃度組，每組4個復(fù)孔，采用棋盤滴定法在液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測熒光值，選取與最高M(jìn)FI值無顯著性差異的工作濃度作為最佳檢測抗體濃度和Streptavidin-PE抗體濃度。

1.3.4 反應(yīng)時間的確定 分為微球-血清反應(yīng)時間，檢測抗體反應(yīng)時間，Streptavidin-PE抗體反應(yīng)時間三個因素。在確定最佳捕獲抗體偶聯(lián)量、最佳檢測抗體和Streptavidin-PE抗體工作濃度的基礎(chǔ)上，將血清反應(yīng)時間分為30、60、90分鐘3個組，檢測抗體反應(yīng)時間分為30、60、90分鐘3個組，Streptavidin-PE抗體反應(yīng)時間分為15、30、45分鐘3個組，每組4個復(fù)孔，采用棋盤滴定法在液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測熒光值，選取與最高M(jìn)FI值無顯著性差異的反應(yīng)時間作為最佳血清反應(yīng)時間、檢測抗體反應(yīng)時間、Streptavidin-PE抗體反應(yīng)時間。

表1 偶聯(lián)微球編號、捕獲抗體及生物素化檢測抗體Tab.1 Fluorescent microspheres，capture antibody and detection antibody in IgG，IgM and IgA group

2 結(jié)果

2.1 熒光編碼微球偶聯(lián)兔IgG、IgM和IgA效率驗證和最佳偶聯(lián)量的優(yōu)化 用Anti-goat-IgG-PE抗體與偶聯(lián)捕獲抗體的微球反應(yīng)，進(jìn)行捕獲抗體偶聯(lián)效率驗證，IgG、IgM和IgA陰性對照孔的熒光值分別為 11.5 MFI、6.8 MFI和 6.5 MFI，均低于 100 MFI。圖1顯示，在IgG、IgM和IgA中，5組偶聯(lián)量梯度(5、10、15、20 和30 μg)的微球，測得的熒光值均大于2000 MFI，證明 IgG、IgM和 IgA捕獲抗體偶聯(lián)成功。

在42號微球中，10 μg IgG捕獲抗體偶聯(lián)量組的MFI值最高，均顯著高于其他4個捕獲抗體偶聯(lián)量組(P＜0.05，P＜0.01);在48 號微球中，20 μg IgM捕獲抗體偶聯(lián)量的MFI值最高，均顯著高于5、10、15 μg IgM 捕獲抗體偶聯(lián)量組(P＜0.05，P＜0.01)，但20 μg與30 μg IgM捕獲抗體偶聯(lián)量組相比則無顯著性差異(P＞0.05);在57號微球中，15 μg IgA捕獲抗體偶聯(lián)量的MFI值最高，均顯著高于5、10和30 μg IgA 捕獲抗體偶聯(lián)量組(P＜0.01)，但 15 μg與20 μg IgA捕獲抗體偶聯(lián)量組比較則無顯著性差異(P＞0.05，圖1)。根據(jù)以上優(yōu)化試驗，IgG、IgM和IgA的最佳偶聯(lián)量分別為10、20和15 μg捕獲抗體。

2.2 兔IgG、IgM和IgA檢測抗體最佳工作濃度的優(yōu)化 biotin標(biāo)記的IgG、IgM和IgA檢測抗體各自稀釋為0.2、0.5、2、5 μg/ml四個濃度組，表2 結(jié)果顯示，在IgG中，5 μg/ml檢測抗體的MFI值最高，顯著高于0.2、0.5 μg/ml檢測抗體組(P＜0.01)，但5 μg/ml與2 μg/ml檢測抗體組無顯著性差異(P＞0.05);在 IgM 中，5 μg/ml檢測抗體的 MFI值最高，顯著高于 0.2 μg/ml、0.5 μg/ml檢測抗體組(P＜0.01)，但5 μg/ml與2 μg/ml檢測抗體組無顯著性差異(P＞0.05);在 IgA 中，5 μg/ml檢測抗體的 MFI值最高，顯著高于 0.2、0.5、2 μg/ml檢測抗體組(P＜0.05，P＜0.01)。據(jù)此，IgG、IgM 和 IgA 檢測抗體最佳工作濃度分別為2、2和5 μg/ml。

圖1 IgG、IgM和IgA捕獲抗體各組偶聯(lián)量的熒光值(MFI)Fig.1 Fluorescence intensity of different conjuctional capacity of capture antibody group in IgG，IgM and IgA(MFI)

表2 各組免疫球蛋白不同檢測抗體濃度的熒光值(MFI)Tab.2 Fluorescence intensity of different concentration of detection antibody group in IgG，IgM and IgA(MFI)

2.3 Streptavidin-PE抗體的最佳工作濃度的優(yōu)化Streptavidin-PE 抗體用1%PBSB 稀釋為1、2、5 μg/ml 3個濃度組，由表3可見，在 IgG、IgM、IgA中，5 μg/ml Streptavidin-PE抗體的MFI值最高，均顯著高于1 μg/ml Streptavidin-PE 抗體組(P＜0.01)，但 5 μg/ml與 2 μg/ml Streptavidin-PE抗體組無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果表明，IgG、IgM和IgA的最佳Streptavidin-PE抗體濃度均為2 μg/ml。

表3 各組免疫球蛋白不同Streptavidin-PE抗體濃度的熒光值(MFI)Tab.3 Fluorescence intensity of different concentration of Streptavidin-PE group in IgG，IgM and IgA(MFI)

2.4 兔IgG、IgM和IgA微球-血清最佳反應(yīng)時間的優(yōu)化 將微球-血清反應(yīng)時間分為30、60、90分鐘3個組，從圖2中可以看出，在IgG、IgM和IgA中，微球-血清作用90分鐘組MFI最高，顯著高于30分鐘組(P＜0.01)，但60分鐘組與90分鐘組無顯著性差異，因此最佳微球-血清反應(yīng)時間為60分鐘。

2.5 兔IgG、IgM和IgA檢測抗體最佳反應(yīng)時間的優(yōu)化 兔IgG、IgM和IgA檢測抗體反應(yīng)時間分為30、60、90分鐘3個組，圖3顯示，IgG、IgM 和 IgA 檢測抗體反應(yīng)90分鐘組MFI均最高，顯著高于30分鐘組(P＜0.01)，但60分鐘組與90分鐘組無顯著性差異，因此檢測抗體最佳反應(yīng)時間為60分鐘。

2.6 Streptavidin-PE抗體最佳反應(yīng)時間的優(yōu)化Streptavidin-PE抗體反應(yīng)時間分為15分鐘、30分鐘、45分鐘3個組，圖4顯示，IgG、IgM和IgA中，Streptavidin-PE抗體反應(yīng)45分鐘組MFI最高，顯著高于15 分鐘組(P＜0.05，P＜0.01)，但 30 分鐘組與45分鐘組無顯著性差異，因此Streptavidin-PE抗體最佳反應(yīng)時間為30分鐘。

圖2 IgG、IgM和IgA微球-血清各反應(yīng)時間組的熒光值(MFI)Fig.2 Fluorescence intensity of different reaction time of beads-serum in IgG，IgM and IgA(MFI)

圖3 IgG、IgM和IgA檢測抗體各反應(yīng)時間組的熒光值(MFI)Fig.3 Fluorescence intensity of different reaction time of detection antibody in IgG，IgM and IgA(MFI)

圖4 IgG、IgM和IgA Streptavidin-PE各反應(yīng)時間組的熒光值(MFI)Fig.4 Fluorescence intensity of different reaction time of Streptavidin-PE in IgG，IgM and IgA(MFI)

3 討論

液相懸浮芯片中所有的反應(yīng)都是在懸浮于液相中的微球表面上進(jìn)行，將反應(yīng)體系由液相-固相反應(yīng)改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應(yīng)體系，對于確保建立在正確的高級結(jié)構(gòu)之上的真實的蛋白質(zhì)的檢測尤為關(guān)鍵，液相環(huán)境有利于抗原抗體的反應(yīng)，如血液樣本中蛋白的檢測［6，7］。液相懸浮芯片在蛋白水平上的檢測基礎(chǔ)是源于抗原-抗體反應(yīng)，將捕獲抗體共價偶聯(lián)到熒光編碼微珠上，微珠表面的羧基與蛋白質(zhì)N末端的氨基發(fā)生羧胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價鍵［8，9］。本文就兔 IgG、IgM 和 IgA 捕獲抗體的偶聯(lián)量進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)IgG、IgM和IgA的最佳捕獲抗體偶聯(lián)量存在差異，在IgG捕獲抗體偶聯(lián)反應(yīng)中，10 μg蛋白偶聯(lián)量組的FI值比15、20和30 μg蛋白偶聯(lián)量組均高，具有顯著差異;在IgM捕獲抗體偶聯(lián)反應(yīng)中，20 μg蛋白偶聯(lián)量的FI值最高，均顯著高于5、10和15 μg蛋白偶聯(lián)量組，而與30 μg蛋白偶聯(lián)量組相比則無顯著性差異;IgA捕獲抗體偶聯(lián)反應(yīng)中，15 μg蛋白偶聯(lián)量的FI值最高，均顯著高于5、10和30 μg蛋白偶聯(lián)量組，而與20 μg蛋白偶聯(lián)量組相比則無顯著性差異(圖1)。提示每種指標(biāo)的捕獲抗體最佳偶聯(lián)量不盡相同，捕獲抗體一旦超出其最佳偶聯(lián)量范圍，可能由于空間位阻效應(yīng)使得具有主要活性成分的Ig分子的Fab端的結(jié)合臂不能充分地微球結(jié)合，從而導(dǎo)致MFI值降低。因此每個蛋白必須摸索出最佳的偶聯(lián)條件，關(guān)鍵是捕獲抗體的偶聯(lián)量。

此外本研究對IgG、IgM和IgA檢測抗體濃度和Streptavidin-PE抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取與最高M(jìn)FI值無顯著性差異的抗體濃度作為最佳工作濃度。在反應(yīng)時間優(yōu)化中，對微球-血清、血清-檢測抗體及Streptavidin-PE抗體作用時間分別進(jìn)行比較分析，最佳反應(yīng)時間分別為60、60和30分鐘，與傳統(tǒng)的雙抗體夾心法ELISA反應(yīng)時間比較一致。根據(jù)上述優(yōu)化的條件，從而制備兔IgG、IgM和IgA液相懸浮芯片，同時這些免疫球蛋白液相懸浮芯片制備條件的優(yōu)化方案可應(yīng)用于其他蛋白的液相懸浮芯片，為建立可應(yīng)用于實驗兔研究的液相懸浮芯片檢測方法和發(fā)展新穎生物診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 Joong-Ho W，Ofir G，Shai S S et al.Significance analysis of xMap cytokine bead arrays［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012;109(8):2848-2853.

2 Houser B.Bio-Rad＇s Bio-Plex?suspension array system，xMAP technology overview［J］.Arch Physiol Biochem，2012;118(4):192-196.

3 McDuffie E，Obert L，Chupka J et al.Detection of cytokine protein expression in mouse lung homogenates using suspension bead array［J］.J Inflamm，2006;3:15.

4 Datta S C，Opp M R.Lipopolysaccharide-induced increases in cytokines in discrete mouse brain regions are detectable using Luminex xMAP technology［J］.J Neurosci Methods，2008;175(1):119-124.

5 Choonara Y E，Pillay V，Danckwerts M P et al.In vivo evaluation of a biodegradable donut-shaped minitablet for prolonged posterior segment drug delivery in the rabbit eye model［J］.J Pharm Sci，2011;100(5):1819-1832.

6 Birtwell S W，Broder G R，Roach P L et al.Multiplexed suspension array platform for high-throughput protein assays［J］.Biomed Microdevices，2012;14(4):651-657.

7 Drago F，Karpasitou K，Spinardi L et al.A microsphere-based suspension array for blood group molecular typing:an update［J］.Transfus Med Hemother，2010;37(6):336-338.

8 Sui W，Tan J，Guo J et al.An altered TH1/TH2 and pro-inflammatory cytokine profile in patients with end-stage renal disease detected by suspension array technology［J］.Ren Fail，2009;31(1):1-5.

9 Wang Y，F(xiàn)ang F，Shi C et al.Evaluation of a method for the simultaneous detection of multiple tumor markers using a multiplex suspension bead array［J］.Clin Biochem，2012;45(16-17):1394-1398.