陳志宏 陳炳智 謝寶貴 劉新銳
(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心,福州 350002)
金福菇(Tricholoma lobayense Heim)是一種高溫型食用菌,適合夏季出菇。它與草菇、靈芝、毛木耳等高溫型或中高溫型食用菌一樣,菌種在低溫(4 ℃)下保藏,經(jīng)常出現(xiàn)菌種死亡問題,而在室溫下保藏則易出現(xiàn)菌種老化。菌種保藏的目的是保持良種的優(yōu)良種性,它是良種保護(hù)的重要環(huán)節(jié)。一般地,菌種處于生長狀態(tài),易出現(xiàn)老化,也易發(fā)生變異,菌種保藏技術(shù)研究就是為了開發(fā)出一種保藏方法,使菌種處于休眠狀態(tài),既不生長也不死亡,以避免變異與老化。目前尚未見到金福菇菌種保藏技術(shù)的相關(guān)報(bào)道,而液氮超低溫保藏菌種已被公認(rèn)為是保持菌種特性不變和存活力持久最為理想的方法[1,2],我們通過對金福菇菌種液氮保藏效果的降溫速率、解凍溫度兩個(gè)方面進(jìn)行研究,探索金福菇菌種的液氮保藏技術(shù),以期應(yīng)用于金福菇種質(zhì)資源的保藏。
1.1 供試菌株 金福菇“Tr0005”和“Tr0001”兩個(gè)菌株均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。
1.2 菌種培養(yǎng)與保藏管制作 聚丙烯飲料管剪成5 cm長,用火焰先把一端溶化封口,滅菌后備用。將已活化2次的PDA平板菌種用小號打孔器截取菌種塊,挑放于無菌聚丙烯飲料管,注入10%甘油,再用火焰封口,靜置過夜。
1.3 降溫程序設(shè)計(jì) 將制備好的保藏管用CryoGenesis(TM)V5程序降溫儀進(jìn)行4個(gè)不同降溫程序處理試驗(yàn)(表1),每個(gè)程序3個(gè)重復(fù),35 ℃解凍。
表1 液氮保藏不同降溫程序處理
1.4 解凍溫度試驗(yàn) 從液氮罐取出表1所列的C降溫程序處理,保藏3個(gè)月后的金福菇菌種,設(shè)置4個(gè)解凍溫度,即室溫(25 ℃左右)、30 ℃、35 ℃、40 ℃,解凍時(shí)間為5 min,每個(gè)解凍處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.5 保藏效果評價(jià)方法 液氮保藏 3個(gè)月后的金福菇菌種經(jīng)解凍,菌種塊用無菌濾紙吸干防凍劑,接種于PDA平板上,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),28 ℃培養(yǎng),記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間,統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率,測量菌絲的日生長速度,觀察菌落特征。
2.1 不同降溫程序?qū)σ旱2匦Ч挠绊?對試驗(yàn)菌株按4種不同降溫程序降溫預(yù)處理后投入液氮中冷凍保藏3個(gè)月,解凍后,活化培養(yǎng)9天,測量數(shù)據(jù)、拍照。試驗(yàn)結(jié)果(圖1、表2)表明,菌種從25℃降到4 ℃的降溫速度很重要,直接放入液氮中,降溫速度太快,菌種易死亡。適合的降溫速度為7 ℃/min。
圖1 不同程序降溫保藏的菌種生長情況
表2 不同降溫程序降溫液氮保藏的效果比較
2.2 不同解凍溫度對液氮保藏效果的影響 經(jīng)3個(gè)月的液氮冷凍保藏,經(jīng)不同解凍溫度處理解凍后活化培養(yǎng)10天,測量數(shù)據(jù)、拍照。結(jié)果(表3)表明:液氮保藏后,通過不同解凍處理方法,菌株萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率、生長速度有差異。35℃解凍的菌株萌發(fā)時(shí)間較短,生長速度較快,菌絲濃密。30℃解凍的菌株次之,室溫下自然解凍與 40℃條件解凍的菌株萌發(fā)率低,生長速度慢。
表3 不同解凍溫度與液氮保藏效果的關(guān)系
自1968年Hwang首先應(yīng)用液氮保藏食用菌菌種以來,液氮保藏因其具有的突出優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[1,3]。但有報(bào)道不同食用菌品種菌株因未對液氮保藏的降溫程序條件進(jìn)行優(yōu)化,導(dǎo)致保藏后仍出現(xiàn)菌種退化和品質(zhì)下降[4,5]。本試驗(yàn)還對福建省食用菌種質(zhì)資源保藏中心的另外2個(gè)菌株Tr0007、Tr0013等進(jìn)行降溫程序、解凍溫度方面的液氮保藏試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,其保藏后的檢測結(jié)果(具體數(shù)據(jù)略)與本文試驗(yàn)菌株的表現(xiàn)規(guī)律相一致,只是在同一保藏條件下存在微小的菌株間的差異。
本研究結(jié)果表明,金福菇菌種經(jīng)程序降溫后的保藏效果比直接放進(jìn)液氮罐中好,萌發(fā)時(shí)間短,菌絲生長快且濃密。先從室溫以7 ℃/min降至4 ℃,再以1 ℃/min降至—40 ℃效果最好。金福菇菌種在保藏后還需要一定的溫度進(jìn)行解凍,以 35 ℃解凍后的菌株萌發(fā)時(shí)間較短,且生長速度較快,菌絲濃密。而影響金福菇菌種液氮保藏效果的因素還較多,如菌種的菌齡和培養(yǎng)基質(zhì)等,尚需要作進(jìn)一步的優(yōu)化研究。
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