陳美元

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福州 350014）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）雜交菌株As2796是福建省蘑菇菌種研究推廣站（現(xiàn)福建省農(nóng)科院食用菌研究所）選育成功的優(yōu)良商業(yè)蘑菇菌株，多年來一直占據(jù)中國(guó)雙孢蘑菇栽培面積的80%以上[1]。在該菌株多年的保藏復(fù)壯、生產(chǎn)供應(yīng)的過程中偶然發(fā)現(xiàn)了 2株退化突變體 2796-3和2796-5。它們?cè)赑DA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)基本正常，但在糞草培養(yǎng)基、棉籽殼培養(yǎng)基和麥粒培養(yǎng)基上均無法正常生長(zhǎng)，在基質(zhì)特別是多糖類基質(zhì)的降解能力上發(fā)生了嚴(yán)重的變異和退化現(xiàn)象。這樣的變異菌種如果流入市場(chǎng)，在 PDA斜面上不斷擴(kuò)繁成一級(jí)母種，而在生產(chǎn)季節(jié)卻不能及時(shí)制作成二級(jí)種和三級(jí)種，將造成供種單位和制種戶極大的經(jīng)濟(jì)和信譽(yù)損失，并將直接損害廣大菇農(nóng)的利益。經(jīng)研究，我們排除了病毒等微生物感染的因素，證明了該退化性狀是基因變異所引起的，并且可以穩(wěn)定遺傳。

由于 As2796菌株的重要性以及它所具有的雙孢蘑菇商品化雜交菌株的代表性，除了在保藏和供種等方面應(yīng)加強(qiáng)檢測(cè)外，對(duì)已發(fā)現(xiàn)的該退化現(xiàn)象進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)差異及分子機(jī)制研究具有重要的理論與實(shí)際意義。在前期研究中，我們對(duì)雙孢蘑菇 As2796正常菌株及其兩個(gè)退化突變體進(jìn)行了mRNA差異顯示（DDRT-PCR）分析[2]，發(fā)現(xiàn)有 9個(gè)片段存在明顯的上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)，序列分析發(fā)現(xiàn)9個(gè)差異片段代表了5個(gè)基因的差異，它們?cè)陔p孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的代碼分別為 191327、199816、135047、193267、193513。在本研究中，我們對(duì)三個(gè)菌株中的這5個(gè)基因及其上游部分調(diào)控序列進(jìn)行克隆與測(cè)序比較，以期獲得這些基因與上游序列在三個(gè)菌株中的差異，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株。雙孢蘑菇雜交菌株As2796及其退化突變體菌株2796-3、2796-5由福建省農(nóng)科院食用菌研究所種質(zhì)資源與遺傳育種研究室保藏并提供。大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

（2）試劑。Wizard SV Gel and PCR Clean-up System （DNA 膠純化試劑盒）、pGEM-T Easy Vector System （PCR產(chǎn)物克隆試劑盒）及 SV Minipreps DNA Purification System（質(zhì)粒提取試劑盒）購(gòu)自Promega公司，PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA Markers及其它試劑均購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

（3）引物。①差異基因編碼序列擴(kuò)增引物：根據(jù)DDRT-PCR分析中獲得的5個(gè)差異基因［2]在雙孢蘑菇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的編碼序列（CDS）設(shè)計(jì)正反向PCR引物，用于擴(kuò)增cDNA中的編碼序列，也可擴(kuò)增DNA中含內(nèi)含子的編碼序列，引物名稱中的數(shù)字與 DDRT-PCR中的差異片段編號(hào)相同，且對(duì)應(yīng)基因編號(hào) 191327、199816、135047、193267、193513。引物序列見表 1。②差異基因上游調(diào)控序列擴(kuò)增引物：根據(jù)DDRT-PCR分析中獲得的5個(gè)差異基因[2]在雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的上游序列設(shè)計(jì)正反向PCR引物，用于擴(kuò)增DNA中差異基因上游約1 200 bp的調(diào)控序列，引物名稱中的數(shù)字與DDRT-PCR中的差異片段編號(hào)相同，且對(duì)應(yīng)基因編號(hào)191327、199816、135047、193267、193513。引物序列見表2。

表1 差異基因編碼序列擴(kuò)增引物

表2 差異基因上游序列擴(kuò)增引物

1.2 試驗(yàn)方法

（1）菌絲的培養(yǎng)。菌種接入常規(guī)PDA斜面培養(yǎng)基，24 ℃培養(yǎng)三周。

（2）總DNA的提取。按美國(guó)Sylvan公司提供的方法并加以改進(jìn)[3]。

（3）目的 DNA片段的擴(kuò)增。按文獻(xiàn)［4]的方法稍加改動(dòng)?？傮w積20 μL反應(yīng)體系中含：10×buffer 2 μL；dNTPs （總 2.5 mmol/L）1.5 μL；模板 DNA（15～20 ng/μL）2 μL；正反向特異引物（約 10 μmol/L）各 1 μL；Pfu（0.5U/μL）2 μL；純水10.5 μL。混勻后在臺(tái)式離心機(jī)上稍加離心，放入PCR儀進(jìn)行下列循環(huán)：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 Cycles；72 ℃10 min；4 ℃保持。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，GeneFinder熒光染料染色拍照。

（4）目的DNA片段的純化、克隆與鑒定。按照 Promega公司 Wizard SV Gel and PCR Clean-up System、pGEM-T Easy Vector System和SV Minipreps DNA Purification System試劑盒說明書進(jìn)行。

（5）克隆子測(cè)序與分析?？寺∽淤|(zhì)粒DNA送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的片段序列用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接與序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常與退化菌株差異基因及其上游序列的擴(kuò)增與克隆

以雙孢蘑菇As2796及其2個(gè)退化菌株的總DNA為模板，用設(shè)計(jì)合成的10對(duì)特異引物對(duì)5個(gè)差異基因帶內(nèi)含子的編碼序列及其上游約 1 200 bp調(diào)控序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均獲得了目標(biāo)條帶（圖1，圖2）。割取這些條帶并進(jìn)行純化，然后克隆到pGEM-T Easy載體中。

2.2 正常與退化菌株差異基因及其上游序列的測(cè)序及比較

圖1 3個(gè)菌株5個(gè)差異基因帶內(nèi)含子CDS的PCR擴(kuò)增圖

圖2 3個(gè)菌株5個(gè)差異基因上游序列的PCR擴(kuò)增圖

圖3 差異基因199816在3個(gè)菌株中的序列比較

對(duì)克隆子質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，比較3個(gè)菌株間的序列，結(jié)果表明除了差異基因199816在3個(gè)菌株中的序列完全一致外（圖3），其余基因與上游序列在三個(gè)菌株中均有幾個(gè)堿基的差異（圖4）。而這些差異在2個(gè)退化菌株中的表現(xiàn)未必一致，重復(fù)擴(kuò)增與測(cè)序的結(jié)果也顯示這些差異并無明顯的規(guī)律性和重復(fù)性。因此它們應(yīng)是PCR擴(kuò)增及測(cè)序過程中產(chǎn)生的誤差，而非實(shí)質(zhì)性差異。

圖4 差異基因135047上游序列在3個(gè)菌株中的序列比較

3 討 論

食用菌菌種在保藏、制種及后續(xù)的栽培過程中，時(shí)有發(fā)生長(zhǎng)勢(shì)變差、出菇延遲、產(chǎn)量下降、品質(zhì)劣變、抗性減弱等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象人們泛稱“退化”。 我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó)，而食用菌菌種的退化又是一個(gè)較為常見的現(xiàn)象，因此國(guó)內(nèi)針對(duì)食用菌生產(chǎn)上的退化現(xiàn)象有較多的綜合性報(bào)道，內(nèi)容包括食用菌菌種退化與老化的現(xiàn)象，可能的因素及防止措施。其中提到退化因素可能有遺傳變異、病毒或雜菌污染、無限傳代、營(yíng)養(yǎng)不良、保藏不當(dāng)、人工選擇偏差等內(nèi)外因[5～7]。但在食用菌的退化機(jī)理研究方面，除了本實(shí)驗(yàn)室對(duì)雙孢蘑菇的叢生變異與基質(zhì)降解能力退化現(xiàn)象有關(guān)于基因變異的初步研究和公開報(bào)道[2，8，9]，以及Magae等[10]在金針菇和Qiu等[11]在平菇中發(fā)現(xiàn)dsRNA病毒感染可導(dǎo)致性狀退化外，未見其他食用菌退化的相關(guān)基因與分子機(jī)理研究的文獻(xiàn)報(bào)道。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)一些在雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化菌株中差異表達(dá)的基因，但這些基因及其上游序列在三個(gè)菌株中未能發(fā)現(xiàn)可重復(fù)的實(shí)質(zhì)性差異。結(jié)合DDRT-PCR結(jié)果我們判斷正常與退化菌株的這些基因在轉(zhuǎn)錄上存在量的差異。但結(jié)構(gòu)基因本身及其上游調(diào)控序列并未發(fā)生實(shí)際的變異，退化更可能是影響胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控蛋白基因變異引起的。這為進(jìn)一步深入研究雙孢蘑菇分解基質(zhì)能力退化的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

［1]王澤生，廖劍華，陳美元.我國(guó)雙孢蘑菇育種研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展［J].食用菌學(xué)報(bào)，2010，（增刊）：19-20.

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