孫 鈺，齊玉凱，劉麗英，李顯耀,3*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018;2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018;3.山東省動物生物技術(shù)與疫病防治重點實驗室, 山東 泰安 271018)

Toll樣受體(TLR)是天然免疫系統(tǒng)中一類PRRs(模式識別受體)，是一類廣泛存在于昆蟲、植物和脊椎動物中進化上高度保守的蛋白質(zhì)家族[1]。TLR4是Toll樣受體家族的重要成員。雞TLR4基因?qū)儆贗型跨膜蛋白受體，位于17號染色體，全長4 452 bp，包含三個外顯子，編碼843個氨基酸[2-3]。TLR4主要識別革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的重要成分LPS[4]。Arbour等[5]發(fā)現(xiàn)人TLR4基因的Asp299Gly和Thr399Ile多態(tài)性與吸入LPS后的低應(yīng)答相關(guān)。Lorenz等[6]發(fā)現(xiàn)Asp299Gly和Thr399Ile多態(tài)性在G-細(xì)菌引起的中毒性休克中起一定作用。Leveque等[3]、李鵬等[7]，宋詠梅[8]分析了雞TLR4第三外顯子SNPs及其基因表達水平與沙門氏菌感染的相關(guān)性?；虻墓δ茏罱K要通過蛋白來行使，TLR4基因的變異也是通過改變TLR4蛋白結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。山東省擁有豐富的地方雞品種資源，如壽光雞、濟寧百日雞和汶上蘆花雞、瑯琊雞等優(yōu)良品種。這些品種具有肉質(zhì)風(fēng)味好，產(chǎn)蛋量高，性成熟早、抗病力和適應(yīng)性強等突出優(yōu)點[9]。作為生物多樣性的組成部分，地方品種資源基因庫是未來雞品種改良和適應(yīng)生產(chǎn)條件變化的遺傳基礎(chǔ)[10]。本研究擬分析TLR4外顯子SNPs對TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并檢測對蛋白結(jié)構(gòu)具有重要影響的SNPs在地方雞種和商業(yè)雞種中的遺傳變異，進一步完善TLR4基因的SNPs信息，為TLR4基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

濟寧百日雞、萊蕪黑雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞、壽光雞均來自原種場，海蘭褐和AA肉雞商品代來自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院試驗雞場，每個群體隨機抽取60只雞，翅下靜脈采血1 mL，EDTA抗凝并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

使用血液DNA提取試劑盒提取雞基因組DNA(天根生化科技有限公司，北京)，提取后使用Eppendorf紫外分光光度計檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3 TLR4基因多態(tài)位點的鑒定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中雞TLR4基因序列(GenBank登錄號：NC_006104)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計7對引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。從7個雞群的420個DNA樣品中各取1 μL構(gòu)成DNA池。以此為模板，用7對引物進行PCR擴增獲得TLR4三個外顯子序列。反應(yīng)體系(25 μL)為2.5 μL 10×PCR buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP (10mM)，上下游引物(10 pM)各0.5 μL，70 μg DNA模板，0.2 μL rTaq酶(5U/μL)和適量無菌水。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，最佳退火溫度(表1)，72℃ 30 s)，最后72 ℃延伸5 min。瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司測序。

表1 TLR4基因測序引物及擴增信息Table 1 The primer sequences and amplification condition of TLR4 gene

1.4 TLR4基因多態(tài)位點選擇及基因分型

根據(jù)測序結(jié)果判斷多態(tài)性位點，并通過單個個體直接測序進行驗證，對確認(rèn)的非同義突變通過TMHMM2.0、SOPMA及Protscal軟件在線分析其對TLR4編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，選擇對TLR4編碼蛋白具有影響的位點進行基因型分析，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如1.3所述。

1.5 SNP位點的遺傳多樣性分析

利用R軟件中的genetics程序包計算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR4基因多態(tài)位點的鑒定結(jié)果

7對引物PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果表明，TLR4基因共檢測到17個SNPs位點。其中第一外顯子1個，第二外顯子2個，第三外顯子14個。

2.2 C77T和G247A位點對TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響

通過分析各SNP位點對TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C77T和G247A位點對TLR4編碼蛋白的親水性及跨膜區(qū)有影響(表2)。

由表2可知，C77T位點由C→T發(fā)生改變時，TLR4編碼蛋白質(zhì)的跨膜螺旋中氨基酸的期望數(shù)目、蛋白質(zhì)前60個氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望數(shù)目、N端在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的總概率及該位置的Proscale得分分別增加了1.49、1.38、0.049和0.267，增加比例分別為3.86%、7.60%、6.30%和13.81%；G247A位點堿基改變時TMHMM預(yù)測結(jié)果及Proscale得分未有明顯改變。G247A位點由G→A發(fā)生改變時，TLR4編碼的蛋白質(zhì)中α-螺旋和延伸鏈的比例分別由48.64%升高到54.92%，2.14%升高到2.61%；β-轉(zhuǎn)角及隨機卷曲的比例由13.29%下降到10.81%，35.94%降到31.55%，C77T位點堿基改變時對α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機卷曲的影響不大。

2.3 TLR4外顯子兩多態(tài)位點的直接測序結(jié)果

如圖2所示，C77T位點存在GG、GA、AA三種基因型，G247A位點存在CC、TC、TT三種基因型。

2.4 TLR4基因兩位點的遺傳多態(tài)性分析

利用直接測序法對C77T和G247A位點在7個不同品種中的基因型進行鑒定，計算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。

表2 C77T和G247A位點對TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響Table 2 The effect of C77T and G247A loci on the structure of TLR4 protein

注：E1. 跨膜螺旋中氨基酸的期望數(shù)目；E2.蛋白質(zhì)前60個氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望數(shù)目；P. N端在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的總概率。

Note：E1.The expected number of amino acids in transmembrane helices；E2.The expected number of amino acids in transmembrane helices in the first 60 amino acids of the protein; P. The total probability that the N-term is on the cytoplasmic side of the membrane.

圖1 TLR4外顯子2多態(tài)性位點的測序結(jié)果a，b分別為C77T，G247A位點的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果；測序引物為反向引物Fig.1 The sequencing results of two loci of TLR4 genesa and b are the sequencing results of C77T and G247 loci, respectively；The reverse primer was used for sequencing

C77T多態(tài)位點在7個雞群中的基因型頻率和等位基因頻率及x2適合性檢驗結(jié)果見表3。

由表3可知，CC基因型頻率為0.58～1.00，TT基因型頻率為0～0.03，CT基因型頻率為0～0.38，等位基因C的頻率為0.78～0.99；海蘭褐中所有個體均為等位基因C，而沒有檢測到等位基因T。該位點雜合度為0.017～0.352，其中魯西斗雞最低，為0.017，壽光雞最高，為0.352。C77T的多態(tài)信息含量為0.012～0.288，其中壽光雞最高，為0.288。x2適合性檢驗表明C77T位點在海蘭褐和汶上蘆花雞兩個群體中偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，在其余5個群體中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

由表4可知，GG基因型頻率為0.07～0.85，AA基因型頻率為0～0.28，AG基因型頻率為0.13～0.90，等位基因G的頻率為0.45～0.92。雜合度為0.154～0.503，其中壽光雞最低，為0.154，海蘭褐和濟寧百日雞最高，為0.503。該位點PIC在壽光雞中最低，為0.141，在濟寧百日雞最高，為0.374。x2適合性檢驗結(jié)果表明G247A位點在海蘭褐和AA肉雞兩個商業(yè)品種中偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，在其余5個地方雞種中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 TLR4基因C77T位點基因頻率和等位基因頻率的分布Table 3 The frequency distributions of genotype and alleles of C77T locus

表4 TLR4基因G247A位點基因頻率和等位基因頻率的分布Table 4 The frequency distributions of genotypes and alleles of G247A locus

3 討 論

TLR4及其信號通路在人類疾病中發(fā)揮著重要作用。TLR4在沙門氏菌感染抗性的研究中具有較大優(yōu)勢，Leveque等[3]對沙門氏菌易感和抗性品系雞TLR4基因序列進行研究，發(fā)現(xiàn)胞外區(qū)第三外顯子中383和611兩個位點的突變只出現(xiàn)在沙門氏菌易感品系雞中。當(dāng)雞感染沙門氏菌后，盲腸、脾組織中的TLR4基因的表達量會增加[11-12]。TLR4的903和1832兩位點的堿基改變，會引起TLR4與沙門氏菌結(jié)合效率的改變，從而引起機體的抗感染反應(yīng)[8]。但TLR4基因的突變造成異常表達與抗沙門氏菌感染的關(guān)系和機制還不清楚。

本研究中，TLR4三個外顯子在7個雞群中共存在17個SNPs，包含10個同義突變，7個非同義突變；其中7個非同義突變在第一、二外顯子上各1個，第三外顯子上5個。有人在北京油雞等12個雞群中也檢測到了位于第一、二外顯子上的C77T和G247A非同義突變位點[8]，與本研究結(jié)果一致。C77T多態(tài)位點，在海蘭褐中僅檢測到CC型，在其他6個雞群中該位點的基因型頻率和等位基因頻率相差不大。在長期的人工選擇和自然選擇中，該位點可能未受到明顯影響。G247A位點在5個地方雞種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而在2個商業(yè)雞種中偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，可能是AA肉雞和海蘭褐在選育過程中所經(jīng)歷的高強度人工選擇影響了該位點的分布。

本研究結(jié)果表明，壽光雞C77T位點的PIC為0.352，屬于中度多態(tài)，其它6種雞群的PIC均為低度多態(tài)，而G247A位點除壽光雞的PIC較低外，其余6個雞群PIC為0.369～0.374，屬于中度多態(tài)。對于只有兩個等位基因的標(biāo)記或基因來說，其最大的多態(tài)信息含量(PIC)只有0.375[13]，該位點的多態(tài)信息含量較高，可以作為分子標(biāo)記，為下一步進行TLR4基因不同基因型與雞革蘭氏陰性菌感染抗性的關(guān)聯(lián)分析提供重要的參考依據(jù)。壽光雞是我國形成歷史較早的地方優(yōu)良品種之一，適應(yīng)性和抗逆性較強，遺傳性能穩(wěn)定[10]。壽光雞TLR4基因2位點PIC與其它6個雞群的差異是否與其某種生產(chǎn)性能或沙門氏菌抗性有關(guān)，還需進一步的試驗研究。

雞TLR4蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個功能區(qū)域組成。胞外區(qū)含有大約16～28個亮氨酸重復(fù)序列(LRR)[14]。LRR特征是亮氨酸間隔分布于幾個固定位點，可加強蛋白質(zhì)之間的黏連，有利于LRR參與對病原微生物或其產(chǎn)物的特征性識別，進而激活TLR4通路[15]。SMART軟件預(yù)測顯示C77T處于跨膜區(qū)，G247A位于第一個LRR中，本文通過TMHMM2.0、SOPMA及Protscal軟件分析預(yù)測C77T和G247A多態(tài)位點的改變對TLR4所編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和跨膜功能有一定的影響，但這種改變是否影響整個TLR4信號通路的激活，是否與抗沙門氏菌感染相關(guān)還需進一步研究。

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