苗永旺，孫利民，童晶晶，李大林，袁躍云，楊滿燦，郝偉峰，霍金龍，楊 潤(rùn)，余仕亮，楊光強(qiáng)，王 群

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225；3. 云南省普洱市畜牧工作站, 云南 普洱思茅區(qū)665000；4. 云南省景東縣畜牧工作站，云南 景東676200)

云南境內(nèi)的無(wú)量山、哀牢山兩山脈之間大多地區(qū)海拔高差大，地形地貌復(fù)雜氣候明顯。在該地區(qū)獨(dú)特的自然生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)鼐用耖L(zhǎng)期的選育形成了獨(dú)特的地方雞種資源。2009年9月經(jīng)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)現(xiàn)場(chǎng)鑒定，把分布于無(wú)量山、哀牢山地區(qū)的烏骨雞資源統(tǒng)稱為無(wú)量山烏骨雞[1]。2011年將之收錄到《中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志》中[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2006年該雞存欄84萬(wàn)只。近年存欄逐年增加，群體數(shù)量呈上升趨勢(shì)。無(wú)量山烏骨雞為常羽烏骨雞，毛色有麻花、黃、白等色。該雞體大結(jié)實(shí)，適應(yīng)性強(qiáng)，烏皮、烏骨、烏肉，肉質(zhì)極佳。中心產(chǎn)區(qū)為云南普洱市景東縣、鎮(zhèn)沅縣和大理州南澗縣。在普洱市的墨江、景谷、寧洱等縣，大理州的漾濞、永平、巍山和云龍等縣也有分布。由于無(wú)量山烏骨雞分布的地理區(qū)域廣，在其大群體內(nèi)形成了具有一定遺傳和生產(chǎn)性能差異的地方雞群體。差異比較明顯的是以分布在普洱景東縣及鄰近地區(qū)的普洱毛腳烏雞群體和以分布在大理南澗縣的綠耳烏雞群體為代表。在外觀上，普洱毛腳烏雞體型高大，屠宰率高，通常腳有脛?dòng)稹⒅河?，故稱“毛腳雞”。毛腳性狀在雞群中較普遍存在，但綠耳性狀只是零星存在。而南澗綠耳烏雞體型中等，綠耳性狀在群體中普遍存在，但毛腳性狀特征在群體中不顯著。過(guò)去，人們對(duì)該地區(qū)家雞研究較少，對(duì)其群體遺傳背景和種質(zhì)遺傳特性知之甚少。采用現(xiàn)代遺傳學(xué)手段對(duì)分布于無(wú)量山、哀牢山地區(qū)不同類型的烏骨雞群體進(jìn)行遺傳背景分析，找出它們間的遺傳差異，對(duì)開發(fā)利用該地區(qū)優(yōu)良地方雞種資源具有重要意義。

高等生物的線粒體DNA(mtDNA)進(jìn)化速率比核基因高數(shù)倍，其控制區(qū)(D-loop region)突變速度又較其它區(qū)域高。因此，mtDNA D-loop積累突變較多，作為遺傳標(biāo)記用于種下遺傳多樣性和群體遺傳組成分析，效果好、靈敏度高[3-4]。目前，世界家雞的mtDNA世系組成及其分布已基本清楚[5-6]，這為我國(guó)地方雞種的遺傳分析奠定了基礎(chǔ)。本研究以mtDNA D-loop第I高變區(qū)長(zhǎng)520 bp的序列為遺傳標(biāo)記，對(duì)普洱毛腳烏雞和南澗綠耳烏雞兩個(gè)地方雞群體進(jìn)行了變異檢測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳組成分析，以期為云南哀牢山、無(wú)量山地區(qū)烏骨雞種質(zhì)資源的類群劃分、保護(hù)和選育利用提供遺傳背景資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究共采集家雞樣品96份，其中包括普洱毛腳烏雞樣品48份(♀：25, ♂：23)、南澗綠耳烏雞樣品48份(♀：24, ♂：24)。樣品分別采自云南省普洱市景東縣和大理州南澗縣，在核心產(chǎn)區(qū)隨機(jī)取樣，樣本個(gè)體間不存在直接血緣關(guān)系。翅下靜脈采血，每只雞2 mL，與DNA保存液混合后，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，用于基因組DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

參照苗永旺等[7]的方法提取基因組DNA，經(jīng)檢測(cè)其純度和濃度，稀釋成100 ng/μL，用于后續(xù)群體變異檢測(cè)分析。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

采用Liu等[5]的引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增和測(cè)序：正向引物：5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'；反向引物：5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3'。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，含模板DNA(50～100 ng)1 μL，ddH2O 19.375 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+濃度15 mM)，dNTP(各2.5 mM)1 μL，正、反向引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶(TaKaRa)0.125 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，最后4 ℃終止反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳檢測(cè)后，采用試劑盒(Promage產(chǎn)品)進(jìn)行回收純化，送百泰克生物技術(shù)有限公司進(jìn)行正、反鏈雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DNAstar軟件包(DNAstar Inc.)對(duì)所得序列進(jìn)行核對(duì)，然后使用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，再用DnaSP 5.0軟件[8]對(duì)群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣度和核苷酸多樣度及核苷酸差異數(shù)等參數(shù)進(jìn)行分析。序列堿基組成分析、突變位點(diǎn)輸出、遺傳距離計(jì)算和無(wú)根系統(tǒng)樹的構(gòu)建，采用MEGA 4.0軟件[9]完成。本文序列單倍型的定義以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中一條紅原雞序列NC_007235為參考序列。

2 結(jié)果和分析

2.1 序列變異分析

本研究96個(gè)家雞樣品mtDNA D-loop序列長(zhǎng)度均為520 bp，共檢測(cè)到31個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中單一變異位點(diǎn)2個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)29個(gè)。根據(jù)突變位點(diǎn)定義19種單倍型。單倍型多樣度為0.884±0.019，核苷酸多樣度為0.01586±0.00035；序列核苷酸差異平均數(shù)為8.250。序列堿基組成A、G、T和C的平均含量分別為27.4%、12.6%、30.2%和29.8%。

在普洱毛腳烏雞中，共檢測(cè)到24個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，序列變異率為4.81%，其中單一變異位點(diǎn)2個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)22個(gè)；序列中T、C、A和G的平均含量分別為30.2%，29.8%，27.4%和12.7%；共定義12種單倍型，獨(dú)有單倍型為6個(gè)，占該群體單倍型總數(shù)的50%(6/12)。該群體單倍型多樣度為0.829±0.039，核苷酸多樣度為0.01559±0.00068；群體內(nèi)序列間核苷酸差異的平均數(shù)是8.106，群體內(nèi)遺傳距離為0.016±0.003。在南澗綠耳烏雞中共檢測(cè)到28個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，序列變異率為5.58%，其中單一變異位點(diǎn)0個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)28個(gè)，共定義了13種單倍型，獨(dú)有單倍型為7個(gè)，占該群體單倍型總數(shù)的53.85%(7/13)。序列堿基A、G、T和C的平均含量分別為27.4%、12.6%、30.3%和29.7%，單倍型多樣度為0.907±0.018，核苷酸多樣度為0.01590±0.00056，序列間平均核苷酸差異數(shù)是8.270，群體內(nèi)遺傳距離也為0.016±0.003。兩群體間遺傳距離為0.019±0.004。在兩群體中檢測(cè)到的變異位點(diǎn)及其單倍型世系分布信息見表1。

2.2 群體遺傳分化和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用鄰接法(Neighbor-jointing, NJ)構(gòu)建的無(wú)根系統(tǒng)樹見圖1和圖2。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，普洱毛腳烏雞序列聚為5大支，而南澗綠耳烏雞聚為6大支。按照Miao等[6]的家雞mtDNA世系劃分及各世系突變模式，可將本研究所有個(gè)體劃分到已命名的家雞A、B、C、E、F和G等世系中。普洱毛腳烏雞與南澗綠耳烏雞的世系劃分與各自系統(tǒng)樹上的支系相一致。普洱毛腳烏雞包含A，B，E，F(xiàn)和G五個(gè)世系，其中A世系占45.83%，B世系占2.08%，E世系占8.33%，F(xiàn)世系占16.67%，G世系占27.09%。A世系在該雞群體中占優(yōu)勢(shì)，其次是G世系。南澗綠耳烏雞包含A，B，C，E，F(xiàn)和G六個(gè)母系世系，其中A世系占22.92%，B世系占14.58%，C世系占4.17%，E世系占10.42%，F(xiàn)世系占16.67%，G世系占31.25%。G世系在該雞群體中占優(yōu)勢(shì)，其次是A世系。

表1 多態(tài)位點(diǎn)信息及所定義的單倍型Table 1 The information of the polymorphic sites, lineage and defined haplotypes

注：ST:為序列NC_007235；圖中點(diǎn)(o)代表與參考序列核苷酸相同；Maojiao代表普洱毛腳烏雞; Lver代表南澗綠耳烏雞。

Note：ST:the sequence NC_007235; Dots (o) are identified with the reference sequence；Miaojiao：Puer maojiao black-bone chicken；Lver: Nanjian Lver black-bone chicken.

圖1 基于普洱毛腳烏雞所有樣品mtDNA D-loop序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Puer Maojiao black-bone chicken

圖2 基于南澗綠耳烏雞所有樣品mtDNA D-loop序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Nanjian Lver black-bone chicken

3 討 論

相對(duì)于單倍型多樣度而言，核苷酸多樣度不受樣本大小和序列長(zhǎng)度的影響，是衡量群體遺傳多樣性的可靠指標(biāo)。本研究在48只普洱毛腳烏雞中發(fā)現(xiàn)24個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，序列變異率為4.81%，核苷酸多樣度為0.01559±0.00068。而在南澗綠耳烏雞中共發(fā)現(xiàn)28個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，序列變異率為5.58%，核苷酸多樣度為0.01590±0.00056。這表明南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性水平高于普洱毛腳烏雞。近年，已有人采用相同的序列區(qū)段為遺傳標(biāo)記，分析了我國(guó)一些地方雞種的遺傳多樣性。已報(bào)道，云南華坪烏骨雞群體的核苷酸多樣度為0.01547±0. 00085[10]，與本研究的兩個(gè)云南地方雞群體相近。對(duì)仙居雞、靈昆雞、來(lái)航雞、白銀耳雞、蕭山雞、白羽烏骨雞的檢測(cè)顯示，這些雞種的核苷酸多樣度從0.00111～0.1239不等，平均值為0.01183[11-13]。包文斌等[13]對(duì)中國(guó)14個(gè)地方雞種的遺傳分析顯示，各群體核苷酸多樣度從0.000～0.01963不等，其中有10個(gè)群體核苷酸多樣度均在0.01510以下。這表明，普洱毛腳烏雞和南澗綠耳烏雞遺傳多樣性在我國(guó)地方雞種中處于較高的水平，揭示其群體遺傳多樣性豐富。這與它們飼養(yǎng)管理粗放，選育程度低的實(shí)際情況相符。

Liu等[5]采用相同的遺傳標(biāo)記對(duì)家雞和紅原雞的mtDNA世系及遺傳分化的研究表明，世界家雞和紅原雞共包含9個(gè)世系，這些世系存在一定的系統(tǒng)地理分布。最近，Miao等[6]基于家雞線粒體全基因組序列構(gòu)建了mtDNA系統(tǒng)發(fā)育樹并對(duì)單倍型類群進(jìn)行了詳細(xì)界定，基于該系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)世界各地大樣本mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)行了重新分析，確定世界家雞及其近緣種紅原雞可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、W和X等世系，從而揭示出分別發(fā)生在南亞和中國(guó)西南及其鄰近東南亞地區(qū)的局部馴化事件。本研究普洱毛腳烏雞樣品具有A、B、E、F和G等5世系；而南澗綠耳烏雞擁有A、B、C、E、F和G等6世系。這表明普洱毛腳烏雞在群體遺傳組成上具有5個(gè)母系血統(tǒng)來(lái)源，而南澗綠耳烏雞具有6個(gè)母系血統(tǒng)來(lái)源，支持家雞多個(gè)母系起源的觀點(diǎn)[5-6]。但兩個(gè)家雞群體的遺傳組成存在明顯差異：普洱毛腳烏雞中未發(fā)現(xiàn)有C世系，A世系占的比例最多，其次為G世系，第三大世系為F世系，B世系占的比例最少；A、G和F世系三者的比例為89.59%。而在南澗綠耳烏雞中，G世系占的比例最多，其次為A世系，F(xiàn)世系為第三大世系，A、G和F世系三者的比例為72.42%；該雞中B世系的比例明顯高于普洱毛腳烏雞，但F世系的比例與普洱毛腳烏雞相當(dāng)。從單倍型來(lái)看，普洱毛腳烏雞中獨(dú)有單倍型占50%，而南澗綠耳烏雞中獨(dú)有單倍型占53.85%，這表明兩者群體具有較大遺傳差異。同時(shí)，兩群體間遺傳距離為0.019±0.004，大于各自群體內(nèi)遺傳距離，揭示兩群體存在一定遺傳分化。普洱毛腳烏雞主要分布于哀牢山地區(qū)，而南澗綠耳烏雞主要分布于無(wú)量山地區(qū)，兩者的遺傳差異可能與兩地家雞群體的長(zhǎng)時(shí)間隔離、遺傳漂變及兩地居民的養(yǎng)殖習(xí)慣和選育差異有關(guān)。

根據(jù)現(xiàn)有世界家雞的mtDNA世系地理分布[5-6]，A和B世系為東亞和東南亞地區(qū)普遍存在的世系，C世系為東亞特有世系，E為南亞和歐美商品雞中普遍存在的世系，F(xiàn)和G為云南及相鄰地區(qū)特有世系。本研究普洱毛腳烏雞群體中云南特有世系占43.76%，東亞和東南亞地區(qū)(含云南)血統(tǒng)占91.67%；南澗綠耳烏雞中云南特有世系占47.92%，東亞和東南亞地區(qū)(含云南)血統(tǒng)占89.58%。這揭示這兩個(gè)地方雞群體在母系血統(tǒng)上主要為東亞和云南及云南周邊地區(qū)地方雞血統(tǒng)。但在它們?nèi)后w中還有少量的屬于南亞和西方商品雞中普遍存在的血統(tǒng)(E世系)，提示它們可能存在一定比例的歐美商品雞血液滲入。

4 結(jié) 論

本研究從母系遺傳角度揭示了云南境內(nèi)哀牢山地區(qū)普洱毛腳烏雞和無(wú)量山地區(qū)南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性和遺傳差異。兩者群體遺傳多樣性較高，南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性相對(duì)高于普洱毛腳烏雞。兩個(gè)地方雞群體存在一定遺傳分化，它們的群體遺傳組成明顯不同，揭示兩群體遺傳差異較大。在血統(tǒng)來(lái)源上，兩者主要為地方土雞血統(tǒng)，但可能有少量商品雞血液滲入。有關(guān)它們的遺傳差異還有必要采用核基因標(biāo)記進(jìn)行深入研究。本研究可為哀牢山-無(wú)量山地區(qū)烏骨雞種質(zhì)資源的類群劃分和保護(hù)提供依據(jù)。

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