，，，* ，，

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801)

環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件調(diào)節(jié)因子(CREM)作為亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，在精子發(fā)生過程中起著重要的作用。在精子變態(tài)過程中，染色質(zhì)凝聚狀態(tài)、精子細(xì)胞核的形狀和大小均發(fā)生改變，過渡蛋白(TP)和精蛋白(protamine)在此過程中發(fā)揮很重要的作用，另外研究還發(fā)現(xiàn)過渡蛋白和精蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有CRE元件，這為CREM 在精子變態(tài)過程中的作用提供了直接依據(jù)[1]。此外，CREM 還調(diào)節(jié)以下基因的表達(dá)：編碼信號(hào)蛋白的基因，如蛋白激酶A 調(diào)節(jié)亞單位II，其作用為參與cAMP 信號(hào)途徑[2]。許多調(diào)控精子變形的重要基因，如魚精蛋白1和2[3]、PHGPx[4]、TP1[5]、RT7[6]、鈣精蛋白[7]和ACE[8]等。其中魚精蛋白1和2是長形精子細(xì)胞的DNA結(jié)合蛋白。另外研究還表明CREM 對(duì)肝臟的再生和增殖[9-10]、心臟功能[11-12]及下丘腦-垂體軸功能以及褪黑激素的節(jié)律產(chǎn)生起很重要的調(diào)節(jié)作用[13]。CREM基因表達(dá)受多重水平調(diào)節(jié)，通過多重水平調(diào)節(jié)形成不同功能活性的蛋白質(zhì)，包括活化型和抑制型。

1991年，F(xiàn)oulkes等[14]首次通過篩選小鼠腦垂體cDNA文庫，獲得小鼠CREM基因 cDNA 序列，為編碼341個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與CREB存在95 %的同源性[15]。隨后，人、狗、大鼠和雞等物種的CREM基因 cDNA序列相繼被克隆。但山羊CREM基因的cDNA序列、結(jié)構(gòu)及功能的研究還沒有報(bào)道。本研究以太行青山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，提取睪丸組織RNA，采用RT-PCR、5’RACE和3’RACE技術(shù)獲取CREM基因cDNA序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)氨基酸序列、功能位點(diǎn)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)及修飾位點(diǎn)，旨在為CREM翻譯后表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用5只成年太行青山羊公羊，對(duì)其實(shí)施閹割手術(shù)，采集睪丸組織，放入已處理過的凍存管后投入液氮保存。

1.2 RNA提取

依照TaKaRa RNAiso Reagent說明書操作要求提取山羊睪丸總RNA，通過Nanodrop-1000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)純度、濃度及A230/A260和A260/A280，然后瓊脂糖變性電泳檢測(cè)RNA的完整性，貯存于-80 ℃冰箱。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的人(S68271.1)、鼠(BC078899)、牛(NM_001034710)、綿羊(NM_001104935)CREM基因同源序列的ORF序列進(jìn)行BLAST分析，在高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增序列特異性引物SP1，5’RACE和3’RACE引物根據(jù)TaKaRa生物公司 RACE Core Set Ver. 2.0試劑盒操作說明要求，通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物交由上海生物工程公司合成，試驗(yàn)所用引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增山羊CREM基因所用引物序列Table 1 Primers used in the analysis of goat CREM gene

1.4 CREM 基因全長cDNA克隆

1.4.1 CREM基因cDNA中間片段克隆 使用SYBR? PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建10 μL反轉(zhuǎn)錄體系：1.5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μL, Random 6(100 μM)0.5 μL, Total RNA 0.5 μL(500 ng), RNase-Free dH2O 6 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA后用作后續(xù)PCR模板，擴(kuò)增引物SP1，構(gòu)建15 μL體系： cDNA模板1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL, 2.5 mM dNTPs 2.0 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL, Primer F(10 μm)0.5 μL, Primer R(10 μm)0.5 μL, ddH2O 8 μL; 反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s, 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 8 min。反應(yīng)結(jié)束后1 %的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.4.2 3’RACE和5’RACE擴(kuò)增 以提取的山羊睪丸組織總RNA為模板，嚴(yán)格按照TaKaRa生物公司RACE Core Set Ver. 2.0試劑盒說明進(jìn)行3’RACE和5’RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收、連接轉(zhuǎn)化、定向克隆至T-Vector，測(cè)序。

1.5 序列分析

分段擴(kuò)增及RACE獲得的山羊CREM基因序列利用DNAStar軟件中的SeqMan程序拼接，拼接產(chǎn)物(核酸序列)用DNAStar軟件中的Edit Seq程序翻譯成氨基酸序列。并通過http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html、http://smart.embl-heidejberg.de/、http://www.rcsb.org/pdb等網(wǎng)站預(yù)測(cè)山羊CREM二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 CREM基因 cDNA特異片段及RACE擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)從成年太行青山羊睪丸組織提取的RNA進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，然后以山羊睪丸cDNA第一鏈為模板，用SP1F、SP1R引物進(jìn)行擴(kuò)增CREM基因cDNA特異性片段，產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈下成像分析，觀察到一條帶，為900 bp左右，與預(yù)期的目的條帶大小相符，說明擴(kuò)增成功。以合成的RACE cDNA為模板，通過套式PCR反應(yīng)，3’RACE和5’RACE分別擴(kuò)增得到約250 bp、1 000 bp的片段(圖1)，將所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(E.coliJM109)，篩選單克隆質(zhì)粒后送上海生工測(cè)序，經(jīng)GenBank BLAST結(jié)果表明，該序列屬于CREM基因3’端和5’端序列。

2.2 CREM基因cDNA全長序列分析結(jié)果

2.2.1 CREM cDNA全長序列的獲得 用DNASTAR軟件SeqMan程序?qū)T-PCR和RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接分析，山羊CREM cDNA 全長序列為1 183 bp(登錄號(hào)：HM 802260)，包含有960 bp的開放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長87 bp，3’非翻譯區(qū)有真核生物典型的PolyA加尾結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 3’RACE和5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL 2000 Marker；1.3’RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物；2.5’RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Products for 3’RACE and 5’RACE

2.2.2 功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè) 應(yīng)用SMART服務(wù)器分析對(duì)結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在319個(gè)氨基酸序列中，73到115之間有一個(gè)“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個(gè)典型的“BRLZ”結(jié)構(gòu)，說明屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。

2.2.3 跨膜區(qū)分析 用ExPASy 提供的在線TMHMM跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析山羊CREM氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)(圖4)。

圖2 山羊CREM基因cDNA及其氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of CREM in goat

圖3 山羊CREM結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.3 Function domain analysis of goat CREM

圖4 TMHMM軟件分析山羊CREM 跨膜區(qū)結(jié)果Fig.4 Prediction of transmembrane regions of goat CREM using TMHMM

2.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 通過GOR方法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖5顯示，山羊CREM蛋白由α-螺旋(約占37.30 %)，β-折疊(約占18.81 %)和卷曲螺旋(約占43.89 %)3種模塊組成，以α-螺旋和卷曲螺旋為主。

2.2.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過SWISS-MODEL軟件在線預(yù)測(cè)所推導(dǎo)的山羊CREM蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。以PDB數(shù)據(jù)庫中的1 kdxB(99.9 ?)被選定為模板，待測(cè)蛋白質(zhì)與模板的序列相似性達(dá)到88.889 %，建模的氨基酸由82～108，評(píng)估值為2.33172e-05，符合建模標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)測(cè)模型見圖7。由圖7可見，山羊CREM蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)核心螺旋。運(yùn)用Swiss-Pdb Viewer 軟件進(jìn)行模型質(zhì)量評(píng)價(jià)。圖8為CREM預(yù)測(cè)3D模型的拉氏構(gòu)象圖。從結(jié)果可以看出，氨基酸在拉氏構(gòu)象圖中較集中的位置形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，基本判斷CREM 3D模型是合理的。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示螺旋結(jié)構(gòu)的全部氨基酸在第三象限的黃色區(qū)域內(nèi)，說明模型可信度高。

圖5 山羊CREM 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Hh.α-螺旋； Ee.延伸鏈；Cc.無規(guī)則卷曲Fig.5 Predicted secondary structure of goat CREM protein Hh. Alpha helix; Ee. Extended strand; Cc.Random coil

2.2.6 序列多重比對(duì)和分子進(jìn)化樹分析 將山羊CREM 基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列分別與GenBank 中已登錄的牛(NM_001034710.2)、綿羊(NM_001104935.1)、狗(X99115)、人(S68271.1)、褐鼠(BC078899.1)的CREM基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示核苷酸同源性分別為96.2%、89.5%、88.9%、85.0% 和90.7%，氨基酸同源性分別為99.4%、85.9%、86.8%、84.7%和96.2%。

并用基于氨基酸序列的NJ 法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)，結(jié)果顯示山羊與牛親緣關(guān)系最近，人次之，與小鼠、褐鼠、馬、狗和綿羊的親緣關(guān)系較為相近，與鮭魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 CREM蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果
Fig.6 Protein tertiary structure prediction of CREM

圖7 CREM的三級(jí)模型拉氏構(gòu)象圖Fig.7 Ramachandran plot of goat CREM

圖8 CREM蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.8 Phylogenetic tree of CREM

3 討 論

自1991年Foulkes等[14]首次獲得小鼠CREM基因cDNA 序列，隨后許多物種的CREM基因cDNA序列被成功克隆。本研究通過RACE技術(shù)成功克隆得到全長1 183 bp山羊CREM基因cDNA序列(登錄號(hào)：HM 802260)，包含有960 bp的開放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長87 bp，3’非翻譯有真核生物典型的PolyA加尾結(jié)構(gòu)。 3’非翻譯區(qū)有一個(gè)“ATTTA”序列，與RNA的穩(wěn)定性有關(guān)[15-16]。山羊CREM基因cDNA序列與牛相似，3’非翻譯區(qū)僅存在一個(gè)PolyA位點(diǎn)，區(qū)別于小鼠等其他哺乳動(dòng)物CREM基因的3’末端的兩個(gè)polyA 位點(diǎn)[17]。對(duì)CREM氨基酸序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)包含兩個(gè)富含谷氨酸結(jié)構(gòu)域，一個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)，以及一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，均屬于CREB亞族典型的功能結(jié)構(gòu)域，表明本研究克隆出的CREM基因cDNA序列及氨基酸序列屬于典型的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。

通過應(yīng)用SMART服務(wù)器對(duì)CREM結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在319個(gè)氨基酸序列中，73～115之間有一個(gè)“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個(gè)典型的“BRLZ”結(jié)構(gòu)，pKID區(qū)域?yàn)榧っ刚T導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，是蛋白激酶對(duì)CREM蛋白進(jìn)行磷酸化的部位[18]，是激活CREM蛋白必不可少的區(qū)域?！癇RLZ”結(jié)構(gòu)為bZIP結(jié)構(gòu)域，其主要作用是調(diào)控蛋白/DNA的相互作用，二聚化是蛋白結(jié)合DNA所必需的，二聚化的蛋白與CRE啟動(dòng)子元件結(jié)合。現(xiàn)已證實(shí)，許多參與精子發(fā)生過程的基因，其啟動(dòng)子位點(diǎn)均含有CREs[19]。因此，bZIP區(qū)對(duì)CREM發(fā)揮正常的生物學(xué)功能是必需的，而且也是保守的。CREM CDS序列同源性分析結(jié)果表明，與牛、綿羊、狗、人和褐鼠同源性分別為96.2 %、89.5 %、88.9 %、85.0 % 和90.7 %，氨基酸序列同源性分別為99.4 %、85.9 %、86.8 %、84.7 %和96.2 %，說明CREM在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。

蛋白質(zhì)的生物功能很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)，致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)成為了目前研究的熱門課題。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，山羊CREM蛋白有α-螺旋、β-折疊和卷曲螺旋3種模塊，以α-螺旋和卷曲螺旋為主。通過同源建模，與PDB數(shù)據(jù)庫中1kdxB (99.9 A)三維結(jié)構(gòu)高度相似，通過Swiss-Pdb Viewer的三級(jí)結(jié)構(gòu)和拉氏構(gòu)象圖同樣也驗(yàn)證了CREM蛋白結(jié)構(gòu)非常保守。本試驗(yàn)通過對(duì)山羊CREM cDNA序列成功克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)深入探討山羊CREM蛋白生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

采用RACE技術(shù)成功克隆出太行青山羊睪丸CREM基因在睪丸組織中cDNA序列，GenBank收錄號(hào)為HM 802260。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)了二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)及功能區(qū)域，通過與牛、綿羊、狗、人和褐鼠等其它物種的同源性及進(jìn)化樹分析，CREM具有亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族同源基因的典型序列特征和功能結(jié)構(gòu)域。

參考文獻(xiàn):

[1] Kotaja N, De Cesare D, Macho B, et al. Abnormal sperm in mice with targeted deletion of the act (activator of cAMP-responsive element modulator in testis) gene[J].Proc Nati Acad Sci U S A,2004,101(29):10 620-10 625.

[2] Dadoune J P. Expression of mammalian spermatozoal nucleo proteins[J]. Microsc Res Tech, 2003, 61(1):56-75.

[3] Hecht N, Cavalcanti M C, Nayudu P, et al. Protamine-1 represents a sperm specific gene transcript: a study in Callithrix jacchus and Bos Taurus[J].Andrologia,2011, 43(3):167-173.

[4] Tramer F, Vetere A, Martinelli M, et al. cAMP-response element modulator-τ activates a distinct promoter element for the expression of the phospholipid hydroperoxide/sperm nucleus glutathione peroxidase gene[J].J Biochem,2004,383:179-185.

[5] Kistler M K, Sassone-Corsi P, Kistler W S. Identification of a functional cyclic adenosine 3’, 5’-monophosphate response element in the 5’-flanking region of the gene for transition protein 1 (TP1), a basic chromosomal protein of mammalian spermatids[J]. Biol Reprod, 1994, 51:1 322-1 329.

[6] Van der Hoorn F A. Identification of the testis c-mos promoter: specific activity in a seminiferous tubule-derived extract and binding of a testis-specific nuclear factor [J].Oncogene, 1992, 7(6):1 093-1 099.

[7] Sun Z, Sassone-Corsi P, Means A. Calspermin gene transcription is regulated by two cyclic AMP response elements contained in an alternative promoter in the calmodulin kinase IV gene [J].Mol Cell Biol, 1995, 15:561-571.

[8] Zhou Y, Sun Z, Means A R, et al. cAMP-response element modulator tau is a positive regulator of testis angiotensin converting enzyme transcription [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(22):12 262-12 266.

[9] Halder S, Fink M, Waterman M, et al. cAMP responsive element binding site is essential for sterol regulation of the human lanosterol 14a α-demethylase gene (CYP51)[J].Mol Endocrinol,2002,16:1 853-1 863.

[10] Acimovic J, Fink M, Pompon D, et al. CREM modulates the circadian expression of CYP51, HMGCR and cholesterogenesis in the liver[J].Biochem Biophys Res Commun,2008, 376(1):206-210.

[11] Mueller F U, Lewin G，Matus M, et al. Impaired cardiac contraction and relaxation and decreased expression of sarcoplasmic Ca2+-ATPase in mice lacking the CREM gene [J].FASEB J, 2003, 17:103-105.

[12] Isoda T, Paolocci N, Haghighi K, et al. Novel regulation of cardiac force-frequency relation by CREM (cAMP response element modulator)[J].FASEB J,2003,17:144-151.

[13] Maldonado R, Smadja C, Mazzucchelli C, et al. Altered emotional and locomotor responses in mice deficient in the transcription factor CREM[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14 094-14 099.

[14] Foulkes N S, Laoide B M, Schlotter F, et al. Transcriptional antagonist cAMP-responsive element modulator (CREM) down-regulates c-fos cAMP-induced expression[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(12):5 448-5 452.

[15] Shaw G, Kamen R A. Conserved AU sequence from the 3’ untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation [J].Cell, 1986, 46:659-667.

[16] Abdel W N, Gibbs J, Mason R M. Regulation of gene expression by alternative polyadenylation and mRNA instability in hyperglycaemic mesangial cells[J]. Biochem J,1998,336:405-411.

[17] Hoeffler J P, Meyer T E, Waeber G, et al. Multiple adenosine 3’, 5’-cyclic adenosine monophosphate response element DNA-binding proteins generated by gene diversification and alternative exon splicing[J].Mol Endocrinol,1990,4:920-930.

[18] Fimia G M, De Cesare D, Sassone-Corsi P. CBP-independent activation of CREM and CREB by the LIM-only protein ACT[J].Nature,1999,398(6723):165-169.

[19] Sassone-Corsi P. CREM: a master-switch governing male germ cell differentiation and apoptosis semin[J].Cell Dev Biol,1998,9:475-482.