郭時(shí)金，徐倩倩，張志美，王艷萍，張 穎，付石軍，沈志強(qiáng)*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600； 2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

清瘟敗毒飲是清代著名溫病學(xué)家余師愚所創(chuàng)制的名方，載于其所著的《疫疹一得》一書中。處方由生石膏、小生地、烏犀角、真川連、梔子、桔梗、黃芩、知母、赤芍、玄參、連翹、甘草、丹皮、鮮竹葉共十四味中藥煎煮而成，藥性專一，作用全面，功在清熱解毒，瀉火涼血。現(xiàn)代研究已報(bào)道，清瘟敗毒飲具有抑制早期膿毒癥患者過度免疫應(yīng)答、減少過度免疫應(yīng)答對機(jī)體自身的損害[1]、改善細(xì)胞免疫水平、有較強(qiáng)的抑菌作用。清瘟敗毒飲對雞白痢、豬高致病性藍(lán)耳病[2-5]有良好地防治效果。清瘟敗毒顆粒是在清瘟敗毒飲基礎(chǔ)上對其中主要成分進(jìn)行單獨(dú)提取，并在此基礎(chǔ)上通過科學(xué)工藝制備的顆粒劑。本研究擬從清瘟敗毒顆粒對雞的抗體效價(jià)水平、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和免疫器官指數(shù)的影響進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為其臨床及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)及實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

30日齡健康非免疫海藍(lán)白公雞(山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供)。海藍(lán)白基礎(chǔ)日糧，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所飼料廠提供。

1.2 藥物

清瘟敗毒顆粒藥物，由山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：200 g/包，1.3 g生藥/g顆粒。批號(hào)為20120210。新城疫活疫苗Cloe30，由山東綠都生物科技有限公司提供。

1.3 試劑和設(shè)備

試劑：RPMI1640 營養(yǎng)液、ConA(Sigma 公司)；10%小牛血清(Hyclone 公司)；MTT(AM-RESCO 公司)；肝素鈉(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)；SDS(Sigma 公司)。

設(shè)備：倒置顯微鏡(Nikon 公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國寶特)；CO2培養(yǎng)箱(Heraeus 公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

海藍(lán)白公雞90只，隨機(jī)分為3組，每組30只，自由飲水和采食，試驗(yàn)組分別為清瘟敗毒顆粒組、對照藥物組(左旋咪唑)、空白對照組。清瘟敗毒顆粒組按雞0.5 g/L自由飲水3 d，對照藥物組按1%自由飲水3 d，空白對照組自由飲用自來水，不給藥。處理3 d 后用2羽份/只Cloe30，點(diǎn)眼、滴鼻。

于免疫0、7、14、21、28 d，各組隨機(jī)抽取10 只雞，翼下靜脈無菌采血，分離血清，用于測定雞新城疫抗體，按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行HI 效價(jià)檢測[6]。

按文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測定[7-8]：無菌采雞心臟肝素抗凝血10 mL，加入10 mL RPMI 1640 完全營養(yǎng)液(含10%小牛血清)，混勻后等分為5 份。將血樣沿離心管管壁緩慢加于4 mL淋巴細(xì)胞分離液上層，離心(2 000 r/min，20min)，吸取淋巴細(xì)胞層，反復(fù)3次。用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活率，同時(shí)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無血清RPMI1640 完全營養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL。

淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及檢測：取RPMI1640營養(yǎng)液(含10% 小牛血清，5 g/mL ConA)加入無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔50 μL；每孔再加4×106個(gè)/mL淋巴細(xì)胞懸液50 μL，即每孔100 μL，以無細(xì)胞RPMI1640營養(yǎng)液調(diào)零。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱(39 ℃、5% CO2、飽和濕度)培養(yǎng)66 h，每孔加濃度為5 mg/mL MTT 15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加10% SDS-0.01 mol/L HCl 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，室溫放置5 min，紫外可見分光光度計(jì)測定OD570nm的吸光值。

免疫器官指數(shù)的測定：于免疫28 d后，各組隨機(jī)抽取10 只雞，捕殺，采用器官重量法進(jìn)行腔上囊、胸腺和脾臟等免疫器官指數(shù)的測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量方差分析，以最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 雞新城疫抗體效價(jià)檢測

由表1可知，清瘟敗毒顆粒組7、14、21、28 d新城疫抗體效價(jià)均高于陽性對照藥物組和空白對照組，差異顯著(P<0.05)；對照藥物組比空白對照組新城疫抗體效價(jià)稍有升高，但差異不顯著(P>0.05)，說明清瘟敗毒顆粒對雞的體液免疫有增強(qiáng)作用，且明顯強(qiáng)于對照藥物。

2.2 外周血T細(xì)胞測定

提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率方面，清瘟敗毒顆粒組與對照藥物組比較，兩組均能提高轉(zhuǎn)化率，差異不顯著(P>0.05)，但與空白對照組相比，差異顯著(P<0.05)，說明清瘟敗毒顆粒具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，提高抗病能力(見表2)。

2.3 免疫器官指數(shù)的測定

由表3可知，清瘟敗毒顆粒組腔上囊、脾臟、胸腺指數(shù)均高于空白對照組與對照藥物組，且差異顯著(P<0.05)，與2.1和2.2的結(jié)果是一致的，即具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)功能。

表1 清瘟敗毒顆粒對雞新城疫抗體效價(jià)的影響Table 1 Influence of Qingwen Baidu Granules to New castle disease antibody titer of fowl

注：同項(xiàng)同列數(shù)據(jù)右上角字母者相同為差異不顯著(P>0.05)；字母者不同為差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Values with superscripts in the same column mean inignificant difference (P>0.05); while those with different ones mean significant difference (P<0.05).The same below.

表2 清瘟敗毒顆粒對雞T細(xì)胞總數(shù)的影響(OD570 nm的吸光值)Table 2 Influence of Qingwen Baidu Granules to totle T-cellular score of fowl

表3 清瘟敗毒顆粒對雞免疫器官指數(shù)的影響Table 3 Influence of Qingwen Baidu Granules to immune organ index of fowl %

3 討 論

機(jī)體血清抗體水平的高低是評(píng)估體液免疫水平的重要指標(biāo)之一，通常血清抗體水平越高說明機(jī)體對該種疫病的抵抗力越強(qiáng)，清瘟敗毒顆粒對雞新城疫抗體效價(jià)有顯著的提高作用，28 d后抗體效價(jià)下降較緩慢，能夠延長在體內(nèi)的時(shí)間。T 淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，T 淋巴細(xì)胞的增殖是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。采用MTT法測得的OD 值與淋巴細(xì)胞增殖率呈正比。本研究結(jié)果表明，服用清瘟敗毒顆粒能夠顯著提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。胸腺、法氏囊和脾臟是禽類重要的免疫器官，它們重量的增加是由其自身細(xì)胞生長發(fā)育和分裂增殖所致，因此免疫器官重量是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫機(jī)能的重要指標(biāo)，而免疫器官指數(shù)提高又是免疫系統(tǒng)成熟的標(biāo)志。在本試驗(yàn)中，對雞腔上囊、脾臟和胸腺等免疫指數(shù)的測定結(jié)果表明，清瘟敗毒顆?？娠@著提高雞免疫器官指數(shù)，促進(jìn)其發(fā)育，從而增強(qiáng)機(jī)體的特異性與非特異性免疫功能。研究表明，桔梗中的桔梗多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用[9]；玄參可以顯著增強(qiáng)小鼠血清抗體水平；甘草多糖能夠提高抗體生成細(xì)胞水平和胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫[10]；丹皮多糖有效部位PSM2b可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能，并對巨噬細(xì)胞具有激活作用[11]，但清瘟敗毒顆粒通過單獨(dú)某種藥物或者多種藥物相互作用實(shí)現(xiàn)免疫增強(qiáng)作用還需要進(jìn)一步研究。

總之，清瘟敗毒顆粒能顯著提高仔雞血清新雞城疫抗體水平，促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，提高仔雞早期免疫器官指數(shù)，說明清瘟敗毒顆?？娠@著促進(jìn)仔雞免疫器官發(fā)育，提高仔雞免疫機(jī)能。

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