劉 華， 邢立強(qiáng)， 趙自剛， 牛春雨

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北張家口075000)

近年來(lái)，淋巴系在危重病發(fā)病學(xué)中的作用受到學(xué)者們的關(guān)注。目前認(rèn)為，危重狀態(tài)下的腸淋巴液回流是導(dǎo)致機(jī)體重要器官結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙以及血管低反應(yīng)性的關(guān)鍵因素［1－2］，是危重病發(fā)展的橋梁［3］。研究也表明，免疫功能紊亂是引起重癥休克后失控的全身炎癥反應(yīng)、進(jìn)而導(dǎo)致器官損傷的重要發(fā)病學(xué)機(jī)制［4］。脾臟含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，調(diào)節(jié)脾組織淋巴細(xì)胞亞群平衡對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有重要意義［5-8］。課題組前期研究表明，腸淋巴管結(jié)扎可調(diào)節(jié)失血－脂多糖大鼠的體液免疫功能［9］，那么，脾作為重要的免疫器官，腸淋巴液回流與休克后脾的關(guān)系如何?值得研究。為此，本研究觀察了腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾組織形態(tài)、細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期與增殖指數(shù)(proliferation index，PI)的影響，進(jìn)一步探討腸淋巴液在休克發(fā)病學(xué)中的作用與意義。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組

18只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) SCXK(軍)2007-004］，體重 230 ～270 g，隨機(jī)均分為假手術(shù)組(sham，僅麻醉與手術(shù))、休克組(shock，復(fù)制失血性休克模型)和休克+引流組(shock+drainage，復(fù)制失血性休克模型并引流腸淋巴液)。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

所有大鼠乙醚誘導(dǎo)麻醉后，經(jīng)肌肉注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，德國(guó)/北京化學(xué)試劑公司分裝)全身麻醉，行股部無(wú)菌手術(shù)，剝離左股靜脈后插管，注射肝素(1 mL/kg，5×105U/L，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)抗凝后，插管，通過(guò)注射器連接WZF-250F2輸液泵(浙大醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，備輸液;剝離右側(cè)股動(dòng)脈后插管，通過(guò)RM6240BD生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean artery pressure，MAP);分離左側(cè)股動(dòng)脈后插管，連接注射器至NE-1000微量抽注機(jī)(New Era Pump Systems)，備放血。腹部手術(shù)，剝離腸淋巴管。待術(shù)畢平均動(dòng)脈血壓穩(wěn)定30 min后，休克組及休克+引流組大鼠均以抽注機(jī)自股動(dòng)脈勻速放血至40 mmHg(1 mmHg=0．133 kPa)，10 min 完成，保留備回輸;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以調(diào)整放血量維持低血壓90 min，復(fù)制失血性休克模型。然后，休克組及休克+引流組均應(yīng)用輸液泵自股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(量為全血量)，時(shí)間30 min。休克+引流組大鼠在維持低血壓1 h后，行腸淋巴管插管，引流休克腸淋巴液至液體復(fù)蘇結(jié)束后3 h;休克組僅行腹部手術(shù)，剝離腸淋巴管;假手術(shù)組僅麻醉、行股部、腹部手術(shù)，不放血及輸液。休克組與休克+引流組動(dòng)物在輸液復(fù)蘇結(jié)束后3 h、假手術(shù)組在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)行腹主動(dòng)脈插管取血(用于其它實(shí)驗(yàn))后，摘取大鼠脾臟，用于下述指標(biāo)的檢測(cè)。

3 脾組織形態(tài)學(xué)觀察

選擇固定位置脾組織，以4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，常規(guī)方法制備組織切片，光鏡下觀察脾臟組織學(xué)變化，并拍片。

4 脾組織細(xì)胞凋亡觀察

選擇固定位置留取脾組織，以4%多聚甲醛液固定4 h后，置30%蔗糖溶液中，待組織沉入容器底部，進(jìn)行冰凍切片，切片厚3μm，貼片;PBS洗滌2次后，滴加Hoechst 33258染液，避光，5 min;PBS洗滌2次后，滴加抗淬滅封片液，封片;以激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，于90-i多功能生物顯微鏡(Nikon)下觀察并采集圖像。

5 脾組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)

取脾組織切片常規(guī)方法脫蠟水化、高壓抗原修復(fù)、PBS沖洗、滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷溶液(50 μL/片)、PBS 沖洗、滴加Ⅰ抗 Bcl-2(1∶100)/或 Bax(1∶100，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗37℃溫箱20 min，PBS洗滌3次、DAB顯色后，蘇木精復(fù)染25s，流水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后觀察。每張片子隨機(jī)采集5個(gè)視野，采用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析軟件讀取灰度值，作為樣本Bcl-2/或Bax表達(dá)的半定量值。細(xì)胞染色呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，灰度值越高，表達(dá)值越低。

6 脾組織細(xì)胞周期與增殖指數(shù)分析

將組織塊在200目的銅網(wǎng)上搓動(dòng)，并同時(shí)用PBS向下沖洗細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，經(jīng)400目網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，應(yīng)用細(xì)胞周期分析試劑盒(BD)染色10 min，用FACSAria流式細(xì)胞儀(BD)進(jìn)行檢測(cè)，ModFit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，統(tǒng)計(jì)各時(shí)相細(xì)胞比例，計(jì)算PI:PI(%)=(S+G2M)/(G0G1+S+G2M)×100%。

7 脾組織細(xì)胞p53蛋白檢測(cè)

按前述方法制備單細(xì)胞樣品后，以4%多聚甲醛液固定0．5 h，0．0005%Triton X-100 處理2 min 以增加膜通透性，PBS洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/管，每個(gè)樣本做雙管，一管加同型對(duì)照20μL，另一管加20μL p53-FITC(克隆號(hào)G59-12，同型對(duì)照克隆號(hào)MOPC-21，試劑盒購(gòu)自BD)，孵育20 min后PBS洗細(xì)胞2次，加入1 mL PBS后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以p53陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率評(píng)價(jià)p53蛋白表達(dá)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊的資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組大鼠脾組織表面包膜平滑，可見(jiàn)淋巴小結(jié)及“生發(fā)中心”，T、B淋巴細(xì)胞豐富而密集，脾索較粗，淋巴細(xì)胞密集，脾竇內(nèi)較多組織細(xì)胞，無(wú)明顯組織學(xué)損傷，見(jiàn)圖1A。休克組淋巴小結(jié)增多，體積變小，未見(jiàn)“生發(fā)中心”，脾索變細(xì)，脾竇擴(kuò)張，巨噬細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞增多，組織學(xué)損傷程度較重，見(jiàn)圖1B。與休克組脾組織學(xué)損傷的表現(xiàn)基本一致，休克+引流組淋巴小結(jié)體積較小，T、B淋巴細(xì)胞較稀疏，未見(jiàn)“生發(fā)中心”，脾小梁相對(duì)集中，脾索變細(xì)，脾竇擴(kuò)張明顯，紅細(xì)胞呈“淤滯”狀態(tài)，細(xì)胞輪廓不清，組織學(xué)損傷程度較休克組輕，見(jiàn)圖1C。

Figure 1．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on pathological changes of spleen tissues in rats(HE staining，×100)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖1 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾組織形態(tài)學(xué)變化的影響

2 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾組織細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下可見(jiàn):假手術(shù)組脾組織細(xì)胞核呈微弱均勻熒光，少見(jiàn)凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖2A;休克組細(xì)胞呈現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞，由于染色質(zhì)高度凝聚，致密濃染，或裂解成碎塊狀，染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，紅髓、白髓和邊緣區(qū)都有分布，尤以白髓區(qū)為多，見(jiàn)圖2B;休克+引流組也有凋亡細(xì)胞，但較休克組少，見(jiàn)圖2C。

3 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

大鼠脾組織細(xì)胞Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)，核膜陽(yáng)性，呈顆粒狀，主要分布于脾臟的白髓部分;Bax陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，白髓和紅髓均有表達(dá)。休克組Bcl-2表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)，休克+引流組Bcl-2表達(dá)顯著高于休克組(P＜0．01)，見(jiàn)圖3;休克組Bax表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0．01)，休克+引流組Bax表達(dá)顯著低于休克組(P ＜0．01)，見(jiàn)圖4。

Figure 2．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the apoptosis of splenocytes in rats(Hoechst 33258 staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖2 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾組織細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on Bcl-2 expression in rat splenocytes(IHC staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖3 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 4．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on Bax expression in rat splenocytes(IHC staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖4 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾細(xì)胞Bax表達(dá)的影響

4 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾細(xì)胞細(xì)胞周期與增殖指數(shù)的影響

與假手術(shù)組比較，休克+引流組G2/M期細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)，其它各期無(wú)顯著差異(P＞0.05);與休克組比較，休克+引流組大鼠G0/G1期細(xì)胞降低(P＜0．01)、G2/M期和PI值顯著增多(P＜0．01)，見(jiàn)圖5、表 1。

Figure 5．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the cell cycle of splenocytes in rats．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖5 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

表1 休克腸淋巴液引流對(duì)大鼠脾細(xì)胞細(xì)胞周期與增殖指數(shù)的影響Table 1．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the cell cycle and proliferation index(PI)of splenocytes in rats(%．Mean±SD．n=6)

5 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠脾組織細(xì)胞p53表達(dá)的影響

如圖6所示，休克組p53表達(dá)明顯強(qiáng)于假手術(shù)組(P＜0．01);休克+引流組大鼠脾細(xì)胞p53表達(dá)較休克組明顯降低(P＜0．01)，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異。

討 論

免疫器官的結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，免疫細(xì)胞增殖活躍或凋亡增多、或不協(xié)調(diào)性抑制均可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，休克組大鼠脾臟出現(xiàn)了一定的組織學(xué)損傷，這與失血引起的缺氧、酸中毒使溶酶體膜的穩(wěn)定性破壞、破裂而致溶酶釋放使大量淋巴細(xì)胞溶解等因素有關(guān)［10］，這可能是機(jī)體免疫功能紊亂的病理學(xué)基礎(chǔ);休克腸淋巴液引流則減輕了脾組織學(xué)損傷的程度，這有利于從免疫器官角度調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。此外，休克后脾組織出現(xiàn)了大量吞噬細(xì)胞，這對(duì)機(jī)體具有一定的代償意義。

Figure 6．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the expression of p53 in rat splenocytes．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖6 休克腸淋巴液引流對(duì)脾組織細(xì)胞p53表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步觀察腸淋巴液引流減輕脾損傷的作用機(jī)制，本研究觀察了腸淋巴液引流對(duì)脾臟組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期與增殖指數(shù)的影響。結(jié)果顯示，休克組大鼠脾組織出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞大多聚集在細(xì)胞富集的白髓區(qū)，T細(xì)胞大量凋亡使機(jī)體細(xì)胞免疫功能受到抑制，這成為失控的全身炎性反應(yīng)、膿毒癥發(fā)生的重要基礎(chǔ)［11］;細(xì)胞凋亡的發(fā)生與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax有關(guān)［12］，本文發(fā)現(xiàn)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低，促凋亡蛋白Bax和p53表達(dá)上調(diào)，脾細(xì)胞增殖指數(shù)降低。有研究指出，p53在參與細(xì)胞周期調(diào)控的同時(shí)，發(fā)揮“分子警察”的功能，可抑制下游蛋白Bcl-2表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生［13-15］。故本文結(jié)果表明，休克后脾組織T細(xì)胞凋亡的機(jī)制與這些因素有關(guān)。

行腸淋巴液引流則減少了大鼠脾臟細(xì)胞的過(guò)度凋亡，這對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能狀態(tài)是有利的;同時(shí)增加了Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)了Bax和p53蛋白表達(dá)，增加了脾細(xì)胞增殖指數(shù)，降低了G0/G1期細(xì)胞數(shù)，增加了G2/M期細(xì)胞數(shù)。這說(shuō)明減少腸淋巴液回流有效、及時(shí)阻斷了凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細(xì)胞凋亡維持在較低水平，從而發(fā)揮了對(duì)脾的保護(hù)作用。這與我室前期發(fā)現(xiàn)腸淋巴管結(jié)扎可減少二次打擊大鼠肺組織細(xì)胞凋亡［16］、休克腸淋巴液下調(diào)微血管內(nèi)皮細(xì)胞促凋亡基因表達(dá)［17］、腸淋巴管結(jié)扎上調(diào)失血性休克大鼠肺組織促凋亡基因表達(dá)［18］的作用是一致的。

總之，失血性休克后大鼠免疫器官脾臟出現(xiàn)了組織損傷、凋亡細(xì)胞數(shù)目增多;腸淋巴液引流減輕了失血性休克大鼠的脾損傷，其機(jī)制與上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax和p53蛋白表達(dá)從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上結(jié)果提示，休克腸淋巴液在重癥休克后免疫功能紊亂的發(fā)病學(xué)中可能發(fā)揮重要作用。至于腸淋巴液引流對(duì)休克大鼠外周血T細(xì)胞亞群、細(xì)胞免疫功能的影響，還有待在以后的研究中進(jìn)一步觀察。