瓜蔞薤白正丁醇部位腺苷含量及特征圖譜

鄢海燕，鄒純才，朱 磊，章圣朋，周文莉，王 潔

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.藥劑學(xué)與生藥學(xué)教研室;2.藥物分析與藥物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

瓜蔞薤白顆粒是采用瓜蔞(由瓜蔞皮與瓜蔞仁按1∶1比例混合)、薤白兩味藥經(jīng)提取有效成分制成的沖劑。瓜蔞開胸滌痰，可擴張冠狀動脈，提高抗缺氧能力，還可抑制血小板聚集;薤白通陽宣痹，有舒張冠狀動脈作用［1］。含氮類化合物是瓜蔞和薤白組方中的活性成分之一［2］，其中代表性成分腺苷的含量在一定程度上反映了瓜蔞薤白顆粒的質(zhì)量，為此本實驗采用高效液相色譜法測定瓜蔞薤白顆粒正丁醇部位腺苷的含量［3－7］并建立該部位的特征圖譜，以其為評價和控制瓜蔞薤白顆粒的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀(含LC-20A真空在線脫氣機，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱溫箱，SPD-M20A檢測器)，腺苷對照品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，含量≥98.0%)甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。10批瓜蔞薤白顆粒(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h的腺苷對照品適量，加乙腈制得含腺苷100 mg/L的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取瓜蔞薤白顆粒2 g，加水15 ml溶解后，置于分液漏斗中，加入等量的水飽和正丁醇萃取三次，取正丁醇層，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。10批瓜蔞薤白顆粒原料來源見表1。

表1 瓜蔞薤白顆粒原料來源Tab 1 Sources the raw Gualou Xiebai granules

2.2 色譜條件 見文獻［8］。

2.3 腺苷色譜峰的確認 瓜蔞薤白顆粒正丁醇提取物的色譜圖，見圖1。樣品中7號峰為腺苷。驗證方法見文獻［8］。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml于 10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.2”項方法取各對照品溶液10 μl進樣，以腺苷進樣的質(zhì)量(μg)作為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理，結(jié)果表明，腺苷在0.10 ～2.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為:Y=3 100 000X+2 433.5，相關(guān)系數(shù) r=0.9998。

2.4.2 精密度試驗 取對照品溶液重復(fù)進樣5次(每次10 μl)，腺苷峰面積積分值的RSD為0.71%。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品5份，精密稱定，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定，計算腺苷百分含量，RSD為1.22%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，在24 h 內(nèi)按0、6、12、18、24 h 間隔進樣 5 次，供試品中腺苷峰面積積分值的RSD為1.03%。

2.4.5 回收率試驗 精密稱取2.0 g已知腺苷含量的樣品6份，分別加入腺苷對照品適量，按“2.2”方法操作，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 瓜蔞薤白顆粒樣品中腺苷的加樣回收率試驗Tab 2 The average recovery rate of adenosine in Gualou Xiebai samples

2.5 樣品含量測定 按上述方法，測定10批瓜蔞薤白顆粒樣品，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Tab 3 Testing results for the sample

2.6 瓜蔞薤白顆粒正丁醇部位HPLC特征圖譜構(gòu)建

2.6.1 特征圖譜的測定 根據(jù)10批次供試品測定結(jié)果，瓜蔞薤白顆粒正丁醇部位高效液相色譜可分離出30多個色譜峰，以所有指紋圖譜同一閾值置譜峰識別窗口(峰面積/所有峰面積的加和)≥0.005，得到共有峰的數(shù)目為10個。10批樣品的特征圖譜見圖1。

圖1 10批樣品的特征圖譜Fig 1 Characteristic spectrum for 10 batches of samples

上述指紋圖譜中，以腺苷峰為參比峰，將其保留時間設(shè)置為1.00，標(biāo)定了10個共有峰，共有峰(相對保留時間)的順序如下:1(0.40)，2(0.43)，3(0.54)，4(0.65)，5(0.78)，6(0.91)，7(1.00)，8(1.17)，9(1.38)，10(1.73)。

2.6.2 指紋圖譜相似度的計算 分別以10批樣品指紋圖譜共有峰峰面積的均值和中位數(shù)建立對照模板，如圖2。利用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法計算指紋圖譜的相似度，2種方法計算的相似度結(jié)果見表4。

圖2 共有模式圖譜Fig 2 Spectrum of common pattern

表4 相似度計算結(jié)果Tab 4 Calculated similarity

3 討論

本實驗通過對梯度洗脫條件的不斷改進，最終確定本實驗的流動相梯度，并對正丁醇提取物中的腺苷進行了定量分析。該法準(zhǔn)確，成分峰峰形良好，重復(fù)性較好，易于操作，因此可將此方法確定為瓜蔞薤白顆粒質(zhì)量控制方法之一。

本實驗對從藥店和藥材市場收集到的瓜蔞和薤白原料制備而成的瓜蔞薤白顆粒中的腺苷成分進行了含量測定。從表3中可以看到腺苷含量的最低為0.325%，最高為0.960%，說明不同產(chǎn)地的瓜蔞、薤白原料對產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量有一定的影響。從圖4可以直觀地看出，10批樣品的色譜峰不完全一致，峰面積或峰高也有較大差別。分別取均值和中位數(shù)建立對照模板，利用相關(guān)系數(shù)和夾角余弦對10批樣品的全譜進行了相似度評價，從表4的結(jié)果中也反映出不同產(chǎn)地的瓜蔞、薤白原料對產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的影響很大，因此應(yīng)強調(diào)中藥材的規(guī)范化種植以確?；颊哂盟幍陌踩行Ш童熜У闹噩F(xiàn)性。

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［8］鄢海燕，鄒純才.瓜蔞薤白顆粒的高效液相色譜特征圖譜及與組方藥味的相關(guān)性［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(4):25－28.