劉 新,張紀梅,代 昭

(天津工業(yè)大學 環(huán)境與化學工程學院,中空纖維膜材料與膜過程國家重點實驗室,天津 300387)

由單層碳原子以正六邊形緊密排列構(gòu)成蜂窩狀二維平面結(jié)構(gòu)的石墨烯[1],具有較大的比表面積及優(yōu)異的電學、力學和熱學性能[2-3].以金屬、金屬氧化物和絕緣的聚合物等附著的石墨烯代替無附著的石墨烯可防止薄片在還原過程中重新堆疊,并形成一個新的以石墨烯為基礎(chǔ)的納米復合材料.由于金納米粒子具有優(yōu)異的導電性和較好的生物相容性,因此石墨烯-金納米粒子復合材料在傳感器等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4-6].電化學DNA傳感器由一個固定DNA片段(探針DNA)電極和用于檢測的電活性雜交指示劑構(gòu)成[7].通常,將探針DNA分子修飾到電極表面構(gòu)成DNA修飾電極,由于單鏈探針DNA與其互補鏈雜交的高度序列選擇性,因此該探針DNA修飾的電極具有極強的分子識別功能.本文采用檸檬酸鈉作為綠色還原劑和穩(wěn)定劑,制備石墨烯-金納米粒子復合材料,利用該復合物的羧基[8]與末端修飾氨基的DNA鍵合,制備新型的DNA生物傳感器.

1 實 驗

1.1 主要試劑與儀器

鱗片石墨購于青島市萊西縣膠體石墨廠.氯金酸、檸檬酸鈉、氧化鋁拋光粉和蒽醌-2-磺酸鈉(AQMS)均為分析純.所用DNA均由上海英杰生物技術(shù)有限公司合成,序列如下：

5′-端用氨基己醇修飾的單鏈DNA探針：5′-HN2-(CH2)6-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′;

目標DNA：5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTG-3′;

完全不互補的單鏈DNA：5′-CGAACGAGAGCAATTCTGGT-3′.

采用紫外-可見分光光度計(Helios-γ型,美國Thermo Spectronic 公司)、X光電子能譜(K-alpha型,英國Thermo Fisher公司)、X射線衍射儀(D8 DISCOVERwith GADDS型,美國BRUKER AXS公司)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,X-50型,日本日立公司)和透射電子顯微鏡(TEM,H7650型,日本日立公司)對產(chǎn)物進行表征;采用電化學工作站(LK2006A型,天津市蘭力科儀器有限公司)進行電化學測試.

1.2 石墨烯-金納米粒子復合材料的制備

用改進的Hummers法制備氧化石墨(GO)[9-10],并超聲離心配置0.1 mg/mL的氧化石墨烯懸浮液.先將25.0 mL上述溶液加入50 mL容量瓶中,再加入30 mg檸檬酸鈉,在100 ℃回流攪拌反應(yīng)2.5 h,快速加入100 μL氯金酸溶液,繼續(xù)攪拌回流30 min,得到紫紅色的石墨烯-金納米復合材料溶液.對產(chǎn)品進行反復水洗和離心處理后,置于真空干燥箱中60 ℃ 烘干,研磨成粉末進行結(jié)構(gòu)表征和性能測試.

1.3 基于石墨烯-金納米粒子復合材料的DNA探針制備

將直徑為3 mm的玻碳電極(GC)分別用0.5 μm和0.05 μm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面,依次用V(水)∶V(乙醇)=1，V(水)∶V(HNO3)=1和二次水超聲清洗.將預(yù)處理后的GC電極用氮氣吹干,先用微量進樣器稱取制備的石墨烯-金納米粒子復合材料(RGO-Au)懸浮液(0.5 mg/mL)5 μL滴于GC電極上,再將電極置于電熱鼓風干燥箱中37 ℃干燥備用.將上述制備的RGO(RGO-Au)/GC電極浸在1 mg/mL的EDC-NHS(1∶1)溶液中50 min,取出用二次水沖洗去除多余的EDC-NHS溶液.用微量進樣器稱取10 μL DNA探針(10 μmol/L)滴加在電極表面后在密閉容器內(nèi)4 ℃恒溫自組裝1 h,將電極取出,依次用Tris緩沖液和二次水沖洗電極表面以除去未組裝的DNA探針,即得到單鏈DNA修飾的電極(ssDNA/RGO(RGO-Au)/GC).

1.4 雙鏈DNA雜交

將ssDNA/RGO(RGO-Au)/GC電極置于含有目標DNA(10-8μmol/L)的10 mmol/L磷酸鹽(PBS)緩沖溶液(pH=7)中,37 ℃恒溫組裝1 h,依次用Tris緩沖液和二次水沖洗電極表面以除去未雜交的目標DNA,即得到雙鏈DNA修飾的電極(dsDNA/RGO(RGO-Au)/GC).將此電極浸入到1 mmol/L的AQMS雜交指示液中40 min,讓其充分嵌入到dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中.為了消除背景峰,再將此電極浸入到PBS溶液中1 h,用于電化學檢測.

1.5 電化學信號檢測

采用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法,以單鏈DNA或雙鏈DNA修飾的電極為工作電極,鉑電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極進行電化學信號檢測.檢測底液：10 mmol/L PBS緩沖溶液(pH=7).循環(huán)伏安法掃描電位為：-0.7～0.1 V,掃描速度為50 mV/s.差分脈沖法參數(shù)為：電壓范圍:-0.6～0 V；電位增量：0.004 V；脈沖幅度：0.05 s；脈沖寬度：0.05 V；脈沖間隔：0.1 s；等待時間：1 s.

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯-金納米粒子復合材料的表征

圖1 氧化石墨、石墨烯和石墨烯-金納米粒子復合材料的紫外光譜(A)及其溶液照片(B)Fig.1 UV-Vis spectra of GO,graphene and graphene-AuNPs hybrid (A) and photos (B) of their solutions

圖2 氧化石墨(A)和石墨烯-金納米顆粒復合材料(B)的C1s XPS譜Fig.2 C1s XPS spectra of GO (A) and graphene-AuNPs hybrid (B)

圖2為氧化石墨和石墨烯-金納米粒子復合材料的XPS C1s譜,與氧化石墨相比,石墨烯-金納米粒子復合材料的XPS C1s譜中含氧官能團的特征峰已顯著減弱,表明通過還原反應(yīng)含氧官能團已大量減少,檸檬酸鈉同時還原出了石墨烯和銀單體.但仍存在環(huán)氧官能團,表明該復合物中含有羧基[8],為探針DNA連接提供了條件.

圖3(A)為石墨烯-金納米粒子復合材料中Au 4f的XPS譜.由圖3(A)可見,在83.7 eV和87.4 eV的峰位分別對應(yīng)Au 4f7/2和Au 4f5/2的結(jié)合能,表明所得產(chǎn)物中金的形態(tài)為單體.圖3(B)為該復合材料的XRD譜.由圖3(B)可見,4個明顯的衍射特征峰分別對應(yīng)金的(111),(200),(220)和(311)晶面,表明在所得產(chǎn)物中生成了單體金.由于XRD譜中不存在其他物質(zhì)的特征峰,表明所得樣品純度較高,峰形尖銳,結(jié)晶情況較好.

圖3 石墨烯-金納米粒子復合材料Au 4f的XPS譜(A)和XRD譜(B)Fig.3 XPS spectra of Au 4f doublet (A) and XRD pattern of graphene-AuNPs hybrid (B)

用SEM和TEM表征石墨烯-金納米粒子復合材料形貌,結(jié)果如圖4所示.由圖4(A)可見,在緊密堆起層狀結(jié)構(gòu)的載體石墨烯邊緣存在較明顯的褶皺與折疊,且在載體表面出現(xiàn)顆粒.為進一步觀察金納米顆粒的負載情況和形貌,將其放大100倍，結(jié)果如圖4(B)所示.由圖4(B)可見,在片層狀的石墨烯載體上均勻分散顆粒狀的單體金,金納米顆粒在石墨烯裙皺處分散較密集,且褶皺越大,金顆粒分布的密集程度越高,這是由于褶皺部位更利于附著金納米顆粒的前驅(qū)體——氯金酸所致.圖4(C)為石墨烯-金復合材料的TEM照片.由圖4(C)可見,顆粒大小相對均一的金納米粒子較好地分散在褶皺的石墨烯表面.

圖4 石墨烯-金納米粒子復合材料的SEM照片(A),(B)和TEM照片(C)Fig.4 SEM photographs (A),(B) and TEM photograph (C) of graphene-AuNPs

2.2 基于石墨烯-金納米粒子復合材料制備的DNA傳感器的電化學性能測試

圖5為不同電極作用下的差分脈沖伏安曲線.由圖5可見,dsDNA/RGO-Au/GC電極遠大于dsDNA/RGO/GC電極的峰電流值,這是由于金納米顆粒具有較小的體積、較大的比表面積和較好的生物相容性,使其與DNA分子相互組裝而保持DNA生物組分的活性,從而加快了DNA與電極表面間的電子轉(zhuǎn)移.因此,在石墨烯片層中滲入金納米顆粒,基于石墨烯-金納米粒子復合材料修飾的DNA電化學生物傳感器具有優(yōu)異的電化學性能.

圖6為電極組裝過程中不同階段的電化學測試結(jié)果.由圖6可見,dsDNA/RGO-Au/GC電極遠大于ssDNA/RGO /GC電極的峰電流值,表明AQMS指示劑與雜交反應(yīng)形成的dsDNA發(fā)生嵌入作用提高了dsDNA/RGO-Au/GC修飾電極的電子傳導能力.dsDNA/RGO-Au/GC修飾電極電位較ssDNA/RGO-Au/GC修飾電極的電位正向移動了68 mV,與文獻[12]結(jié)果相符,進一步表明AQMS已嵌入dsDNA中.通過多次重復實驗表明,峰電流值明顯增大是由于DNA雜交所致.RGO-Au/GC電極大于GC電極的背景電流,進一步說明了石墨烯-金納米粒子具有優(yōu)良的導電性能.

圖5 不同電極的差分脈沖伏安曲線Fig.5 DPVs of different electrodes

圖7 當c(AQMS)=1 mmol/L時DNA探針與完全不互補單堿基錯配和完全互補目標DNA雜交后修飾電極的差分脈沖伏安曲線Fig.7 DPVs of after hybridization with non-complementary target DNA and a complementary target DNA at c(AQMS)=1 mmol/L

將ssDNA/RGO-Au/GC修飾電極進行特異性實驗,結(jié)果如圖7所示.由圖7可見,在ssDNA探針與完全不互補的寡核苷酸雜交后,其AQMS曲線與雜交前ssDNA探針修飾電極的曲線差異較小,這是由于未發(fā)生雜交反應(yīng),AQMS無法嵌入到dsDNA的螺旋結(jié)構(gòu)中,因此工作電極上未積累更多的AQMS,峰信號基本不變；當ssDNA探針與單堿基錯配的目標DNA序列雜交后,其AQMS峰電流大于雜交前的電流,與完全互補目標DNA序列雜交后,AQMS峰電流比單堿基錯配的目標DNA序列峰電流進一步增強.表明基于石墨烯-金納米粒子固定的ssDNA探針具有較好的序列選擇性,可區(qū)分完全互補序列和單堿基錯配序列,實現(xiàn)對DNA單堿基突變的識別和檢測.

本文在相同測試條件下,用相同濃度完全互補的目標DNA進行多次重復測試,所測得的峰電流值分別為8.956×10-5,8.896×10-5,8.903×10-5A,平均值為8.918×10-5A,表明制備的DNA探針具有較好的重復性.

綜上所述,本文制備了石墨烯-金納米粒子復合材料,金納米粒子均勻分散在石墨烯層上.利用復合物上的羧基與末端修飾氨基的DNA發(fā)生鍵合,制備了DNA探針.通過差分脈沖法檢測表明,基于石墨烯-金納米粒子修飾的DNA傳感器可選擇性區(qū)分單堿基錯配的目標DNA序列,該傳感器具有較高的特異選擇性.

[1] Geim A K,Novoselov K S.The Rise of Graphene [J].Nature Materials,2007,6(3):183-191.

[2] Rao C N R,Sood A K,Subrahmanyam K S.Some Novel Attributes of Graphene [J].J Phys Chem Lett,2010,1(2):572-580.

[3] Balandin A A,Ghosh S,Bao W Z,et al.Superior Thermal Conductivity of Single-Layer Graphene [J].Nano Lett,2008,8(3):902-907.

[4] Pruneanu S,Pogacean F,Biris A R,et al.Novel Graphene-Gold Nanoparticle Modified Electrodes for the High Sensitivity Electrochemical Spectroscopy Detection and Analysis of Carbamazepine [J].J Phys Chem C,2011,115(47):23387-23394.

[5] Sundaram R S,Steiner M,Chiu H Y,et al.The Graphene Gold Interface and Its Implications for Nanoelectronics [J].Nano Lett,2011,11(9):3833-3837.

[6] YANG Xi,XU Ming-sheng,QIU Wei-ming,et al.Graphene Uniformly Decorated with Gold Nanodots:insituSynthesis,Enhanced Dispersibility and Applications [J].J Mater Chem,2011,21:8096-8103.

[7] ZHAO Yuan-di,PANG Dai-wen,WANG Zong-li,et al.Electrochemical Deoxyribonucleic Acid Sensors [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,1996,24(3):364-368.(趙元弟,龐代文,王宗禮,等.電化學脫氧核糖核酸傳感器 [J].分析化學,1996,24(3):364-368.)

[8] CHEN Yun,LI Yang,SUN Dong,et al.Fabrication of Gold Nanoparticles on Bilayer Graphene for Glucose Electrochemical Biosensing [J].J Mater Chem,2011,21:7604-7611.

[9] Hummers W S,Offeman R E.Preparation of Graphitic Oxide [J].J Am Chem Soc,1958,80(6):1339.

[10] Kovtyukhova N I,Ollivier P J,Martin B R,et al.Layer-by-Layer Assembly of Ultrathin Composite Films from Micron-Sized Graphite Oxide Sheets and Polycations [J].Chem Mater,1999,11(3):771-778.

[11] Alvarez M M,Khoury J T,Schaaff T G,et al.Optical Absorption Spectra of Nanocrystal Gold Molecules [J].Phys Chem B,1997,101(19):3706-3712.

[12] HUANG Hai-zhen,YANG Xiu-rong.Progrcess in Deoxyribonucleic Acid Electroanalysis [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2002,30(4):491-497.(黃海珍,楊秀榮.脫氧核糖核酸電分析化學研究進展 [J].分析化學,2002,30(4):491-497.)