錢小成，楊好強(qiáng)，趙鳳霞，潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖241000)

刺胞動(dòng)物門(mén)水螅綱的淡水水螅是適合進(jìn)行形態(tài)發(fā)生和個(gè)體發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究的重要模式生物［1-3］，因?yàn)樗＞哂泻?jiǎn)單的單個(gè)極性體軸(口區(qū)-胃區(qū)-足區(qū))［4，5］。極性體軸的一端為由口、垂唇和圍繞口邊緣著生的數(shù)根觸手構(gòu)成的口區(qū)，另一端為由柄和位于身體末端的基盤(pán)構(gòu)成的足區(qū)，而介于口區(qū)和足區(qū)之間的區(qū)域即為胃區(qū)，柄和胃區(qū)的交界處為無(wú)性生殖的出芽區(qū)。在自然狀態(tài)下，水螅的基盤(pán)固著于水中物體的表面、水螅體舒展伸長(zhǎng)，其身體另一端即頭區(qū)的觸手自然延長(zhǎng)下垂捕獲水中快速運(yùn)動(dòng)的小型節(jié)肢動(dòng)物溞類、與此同時(shí)觸手上分布的大量刺細(xì)胞釋放刺絲囊麻醉或殺死獵物，而后觸手迅速收縮把獵物吞進(jìn)胃循環(huán)腔。因此水?；P(pán)的固著行為是水螅進(jìn)行正常捕食活動(dòng)的前提條件。

長(zhǎng)期以來(lái)，一直認(rèn)為水螅是靠基盤(pán)粘液細(xì)胞分泌的粘液粘附于固著物表面［6-8］，但有關(guān)水?；P(pán)固著行為及機(jī)理的相關(guān)信息非常有限，比如基盤(pán)吸附面與固著物表面之間吸附力的確切來(lái)源、粘液細(xì)胞在基盤(pán)吸附面上的分布情況等目前知之甚少。本研究組在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)水螅時(shí)發(fā)現(xiàn)，有時(shí)為了清潔培養(yǎng)水螅的玻璃燒杯、需要把水螅移到另外一個(gè)燒杯中，有些固著在燒杯側(cè)壁上的水螅個(gè)體與燒杯壁表面間的粘附力很強(qiáng)、以至于用玻璃吸管多次沖水都不能讓水?；P(pán)與燒杯壁分離，直至增大沖水力度導(dǎo)致水螅身體中間斷裂時(shí)基盤(pán)還不能與燒杯壁分離，該現(xiàn)象對(duì)基盤(pán)與固著物之間粘附力僅來(lái)自粘液的觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑?；P(pán)粘液細(xì)胞是水螅身體上一種特化的終端分化細(xì)胞，除了能分泌粘多糖物質(zhì)到細(xì)胞外形成粘液外，它還有一個(gè)重要特征是其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)一種水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶，該酶在粘液細(xì)胞中高量表達(dá)，把水?；铙w放入含有ABTS［2，2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)］和H2O2的反應(yīng)體系中，基盤(pán)中表達(dá)過(guò)氧化物酶的粘液細(xì)胞能被染成紫紅色［9］?；诖?，本研究除了詳細(xì)觀察了水?；P(pán)的固著行為、還利用上述的ABTS組織化學(xué)方法對(duì)粘液細(xì)胞在基盤(pán)吸附面上的分布模式進(jìn)行了顯示，另外本文還對(duì)水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶基因進(jìn)行了分子克隆，期望探討該酶高量表達(dá)與基盤(pán)固著行為之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水螅為本實(shí)驗(yàn)室培育的大乳頭水螅(Hydra magnipapillata)中國(guó)品系單克隆無(wú)性繁殖系，原種采自安徽省蕪湖市汀堂公園水塘(31°21'39.2″N，118°22'51.46″E)。水螅每天喂食一次鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體(Artemia sp.)，喂食1 h后更換培養(yǎng)液，然后維持在溫度22℃ ±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中(光照強(qiáng)度=2000 LX，LD：HD=12 h ：12 h)。

1.2 水?；P(pán)固著行為及形態(tài)學(xué)觀察

借助本研究組大乳頭水螅規(guī)模化培養(yǎng)平臺(tái)，在喂食后換培養(yǎng)液時(shí)挑取一些基盤(pán)沒(méi)有固著的水螅，置于凹玻片、再添加適量培養(yǎng)液，Olympus數(shù)碼顯微鏡下進(jìn)行連續(xù)觀察和記錄。

1.3 基盤(pán)固著時(shí)基盤(pán)吸附面的組織學(xué)觀察

在水螅培養(yǎng)平臺(tái)上挑選有水螅在側(cè)壁上固著的水螅培養(yǎng)燒杯，先進(jìn)行快速微波固定(微波爐頻率2450 MHZ，功率800 W)1 min，然后Bouin氏固定液再固定15～20 min，梯度酒精脫水，水螅標(biāo)本定位后石蠟包埋，做7 μm厚度的切片，蘇木精及伊紅雙染，Olympus數(shù)碼顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 基盤(pán)過(guò)氧化物酶表達(dá)的檢測(cè)

通過(guò)ABTS細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)水螅基盤(pán)粘液細(xì)胞分子標(biāo)志物過(guò)氧化物酶的表達(dá)，觀察水螅基盤(pán)粘液細(xì)胞在基盤(pán)吸附面上分布模式。將水螅置于白色陶瓷比色板上(每孔1只水螅)，每孔分別加入350μL新鮮配制的ABTS染色混合液(655 mmol/L檸檬酸、345 mmol/L 檸檬酸鹽和 1%ABTS 溶液各 700 μL，70 μL 0.3%H2O2，雙蒸水定容至7 mL)［10］，反應(yīng)20 min 后用雙蒸水洗滌2次，加入300 μL 2%NaF溶液，然后通過(guò)Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和拍照。

1.5 基盤(pán)過(guò)氧化物酶基因的分子克隆

1.5.1 大乳頭水螅總RNA的提取及mRNA的純化

取200條大乳頭水螅，停止喂食3 d后用 Trizol試劑提取總RNA。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？俁NA提取后，溶于無(wú)RNA酶的水中，-70℃冰箱備用。取50 μL總 RNA并按 Oligotex mRNA Purification Kit說(shuō)明書(shū)純化mRNA。

1.5.2 SMART RACE cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)操作基本按SMARTTM cDNA Library Construction Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取3 μL mRNA樣品約0.5 μg，加到0.2 mL的反應(yīng)管中，按說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑及引物，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;采用LD-PCR(longdistance PCR)技術(shù)合成第二鏈cDNA。

1.5.3 大乳頭水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶全長(zhǎng)cDNA序列的擴(kuò)增及序列分析

根據(jù)水螅核基因組計(jì)劃由DNA數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶cDNA序列(GenBank序列號(hào):NW_002092004)［11］設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(HMPPOD-F:5'-tattcatttgtttaatataac-3';HMPPOD-R:5'-tgattagaatataaacttat-cac-3')，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以上述RACE cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶基因全長(zhǎng)cDNA序列。PCR總反應(yīng)體積為50 μL，其中含10 × buffer 5 μL，25 mmol MgCl23.0 μL，2.5 mmol dNTP 2.0 μL，引物(10 μmol)各 1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL(Takara，5 U/μL)，DNA 模板5 ～10 ng，使用滅菌后去離子水將反應(yīng)總體積補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)體系95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，42℃復(fù)性30 s，68℃延伸90 s，循環(huán)次數(shù)為37;72℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)、成像。

PCR產(chǎn)物用柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒經(jīng)切膠純化后用T/A Cloning Kit(TaKaRa)連接到克隆載體pMD 18-T vector中，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆。單克隆菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取并純化質(zhì)粒，采用通用引物M13和M13 Reserve在LI-COR DNA測(cè)序儀上進(jìn)行雙向序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 水?；P(pán)固著行為的動(dòng)態(tài)觀察

為描述方便，把水螅基盤(pán)固著過(guò)程分為3個(gè)時(shí)期。

2.1.1 固著準(zhǔn)備期

水螅身體舒展伸長(zhǎng)，基盤(pán)端逐漸靠近載玻片玻璃表面，最終緊貼載玻片(圖1A-B)。

2.1.2 吸附面形成期

基盤(pán)與載玻片接觸的吸附面面積逐漸擴(kuò)大(圖1C)，吸附面的粘液細(xì)胞分泌大量粘液，由于基盤(pán)吸附面緊貼載玻片，所以較多的粘液從基盤(pán)吸附面與載玻片間被擠壓出來(lái)(圖1D)。

2.1.3 “吸墊”形成期

吸附面形成后約20 min在顯微鏡下可以清晰觀察到僅僅吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面直接接觸、而吸附面中央?yún)^(qū)域不與固著物表面直接接觸，即基盤(pán)吸附面形成類似“吸墊”的結(jié)構(gòu)(圖1E)。對(duì)固著時(shí)的基盤(pán)進(jìn)行微波快速固定后的組織學(xué)研究結(jié)果直接證實(shí)了基盤(pán)吸附面中央?yún)^(qū)域與固著物表面不直接接觸、而是朝胃循環(huán)腔方向形成凹陷(圖1H)。另外，基盤(pán)吸附面形成類似“吸墊”結(jié)構(gòu)后，吸附面的圓形周邊區(qū)域的外胚層細(xì)胞沿著載玻片表面形成許多片狀偽足和絲狀偽足(圖1F-G)。

2.2 水螅基盤(pán)粘液細(xì)胞分子標(biāo)志物水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶的表達(dá)模式

通過(guò)ABTS組織化學(xué)方法顯示水?；P(pán)粘液細(xì)胞分子標(biāo)志物基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶僅在基盤(pán)吸附面的周邊區(qū)域外胚層細(xì)胞中表達(dá)(圖2)、而吸附面中央?yún)^(qū)域無(wú)表達(dá)，這個(gè)表達(dá)模式表明粘液細(xì)胞在基盤(pán)吸附面上不是均勻分布的，而僅分布在吸附面的周邊區(qū)域即吸附面與固著物直接接觸的部位。

圖2 大乳頭水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶的表達(dá)模式Fig 2 The expression pattern of foot-specific peroxidase in Hydra magnipapillata

2.3 水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶基因的克隆和序列分析

水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小和預(yù)期片段大小接近(圖3)，PCR產(chǎn)物測(cè)序后得到的cDNA序列已提交GenBank(GenBank登錄號(hào):JF951860)，該序列中蛋白質(zhì)編碼區(qū)共873 bp、編碼290個(gè)氨基酸(圖4)、其中第246核苷酸位點(diǎn)(C)與水螅核基因組計(jì)劃由DNA數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶cDNA序列相應(yīng)位點(diǎn)(T)的堿基不同。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線BLAST分析后發(fā)現(xiàn)該酶蛋白氨基酸序列中隱含2個(gè)類似fascin蛋白的結(jié)構(gòu)域(圖5)，它們分別位于基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶氨基酸序列的38～154位點(diǎn)及117～244位點(diǎn)。

3 討論

從本研究的諸多結(jié)果綜合起來(lái)看，水?；P(pán)固著時(shí)基盤(pán)吸附面與固著物間的吸附力可能有以下3個(gè)來(lái)源。首先，吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面直接接觸、而吸附面中央?yún)^(qū)域不與固著物表面直接接觸(圖1E)，即基盤(pán)吸附面形成類似“吸墊”的結(jié)構(gòu)應(yīng)是基盤(pán)吸附力的主要來(lái)源。吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面緊貼、從而起著封固作用，使得吸附面中央?yún)^(qū)域與固著物表面之間形成的空隙與外界水體隔絕，這個(gè)空隙區(qū)域相當(dāng)于是一個(gè)負(fù)壓區(qū)或低壓區(qū)、內(nèi)部可能沒(méi)有水或有部分水。其次，基盤(pán)粘液細(xì)胞分泌的粘液在基盤(pán)吸附力的形成中演繹著重要角色，在基盤(pán)吸附面“吸墊”結(jié)構(gòu)形成之前，粘液提供了基盤(pán)吸附面與固著物間初步的吸附力;在“吸墊”結(jié)構(gòu)形成之后，吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面間的粘液起著封固劑的作用、以保持吸附面中央?yún)^(qū)域與固著物表面之間空隙中的負(fù)壓狀態(tài)。第三，吸附面圓形周邊區(qū)域外胚層細(xì)胞沿著載玻片表面形成的許多偽足增強(qiáng)了基盤(pán)吸附面的吸附力。

通過(guò)ABTS組織化學(xué)方法顯示水?；P(pán)粘液細(xì)胞分子標(biāo)志物基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶僅在基盤(pán)吸附面的周邊區(qū)域外胚層細(xì)胞中表達(dá)(圖2)，而吸附面中央?yún)^(qū)域無(wú)表達(dá)，這個(gè)表達(dá)模式表明粘液細(xì)胞在基盤(pán)吸附面上不是均勻分布的，而僅分布在吸附面的周邊區(qū)域即吸附面與固著物直接接觸的部位，也說(shuō)明基盤(pán)吸附面的周邊區(qū)域外胚層細(xì)胞是基盤(pán)粘液細(xì)胞。對(duì)基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明，基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶氨基酸序列中包含fascin蛋白的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。fascin蛋白是一種小分子球狀蛋白，在細(xì)胞表面細(xì)胞膜突起的形成中起重要作用［12］。在一些小分子蛋白質(zhì)因子如G-protein Rac等因素的激發(fā)下，細(xì)胞質(zhì)中散亂的actin分子逐漸向細(xì)胞膜方向轉(zhuǎn)移，同時(shí)細(xì)胞膜向外突起形成偽足，在fascin蛋白的作用下有序交聯(lián)起來(lái)的actin分子聚合體就是偽足中的支撐物［13-15］。因此，水?；P(pán)特異性過(guò)氧化物酶可能具有的fascin蛋白活性有助于基盤(pán)粘液細(xì)胞偽足的形成、從而增強(qiáng)基盤(pán)對(duì)固著物的吸附力。

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