張 劼，李秀娟

(1.重慶市第三人民醫(yī)院老年科，重慶 400014;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院一分院普內(nèi)科，重慶 400015）

嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia，Sm)為條件致病菌，隨著抗生素和免疫抑制劑的大量應(yīng)用，其分離率在非發(fā)酵菌中呈上升趨勢(shì)并對(duì)多種抗生素耐藥。噬菌體是一類細(xì)菌病毒，能在菌體內(nèi)快速增殖并最終裂解細(xì)菌，從而達(dá)到抗菌作用。本研究以臨床分離的Sm為指示菌，從醫(yī)院污水中分離并得到相對(duì)應(yīng)的噬菌體，以探討其生物學(xué)特征及其在感染動(dòng)物模型中的作用，為噬菌體應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)［1］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株 BABLc小鼠(SPF級(jí)，20 g)來自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)菌株來自重慶巿臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 試劑 SDS、溶菌酶、蛋白酶 K、PEG8000、EDTA、DNA酶、RNA酶及 LB培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;限制性內(nèi)切酶 BamHI、EcoRI、PstI、XbaI、XhoI、BglII、AatⅡ、DraI、NheI、SacI及SaII購(gòu)自加拿大Fermentas公司;通用引物27f和1492r購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離及宿主范圍的測(cè)定 取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院污水1 L，將21株Sm菌液和LB 50 ml加入污水中培養(yǎng)，24 h后過濾除菌。采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法，將10μl處理后的污水與200μl宿主菌混合，加入50℃融化的半固體LB培養(yǎng)基2 ml混勻，傾倒于固體LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。次日可見單個(gè)噬斑，單個(gè)噬斑經(jīng)過3次反復(fù)純化后得到單一噬菌體［2］。21株Sm制成菌板，將分離所得的8株噬菌體(108PFU/ml)各取10μl滴在上述菌板上，37℃培養(yǎng)。對(duì)宿主菌具有裂解作用的噬菌體可在菌板上形成透亮的噬斑，從而得到各自噬菌體的宿主范圍。

1.2.2 噬菌體SM1的電鏡觀察 取噬菌體懸液20μl滴于銅網(wǎng)上，待其自然沉淀30 min后，加1滴2%磷鎢酸于銅網(wǎng)上，染色10 min，干燥后用透射電鏡觀察。

1.2.3 噬菌體SM1最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)、一步生長(zhǎng)曲線、細(xì)菌耐受噬菌體突變率的測(cè)定 感染復(fù)數(shù)是指平均每個(gè)細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量，產(chǎn)生最多子代噬菌體的MOI為最佳 MOI［3］。為了保證每條細(xì)菌只能被1個(gè)噬菌體感染，不影響噬菌體數(shù)量的測(cè)定，采用低復(fù)數(shù)感染取MOI=0.1。噬菌體與宿主菌混合37℃ 5 min后離心棄上清，洗滌去除未吸附宿主菌的游離噬菌體，37℃振蕩培養(yǎng)。事先設(shè)定好間隔時(shí)間點(diǎn)，于每個(gè)點(diǎn)取樣100μl測(cè)定噬菌體滴度。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線［4］。將宿主菌10倍連續(xù)稀釋，直至10-12。于10-6～10-12稀釋管中各取樣10μl測(cè)出細(xì)菌數(shù)。每個(gè)稀釋度管中分別加入噬菌體液，可見各管逐漸開始變清，繼續(xù)培養(yǎng)，菌液管又開始逐漸返濁。能返濁的最低濃度管中所含細(xì)菌數(shù)的倒數(shù)即為細(xì)菌耐受噬菌體SM1的突變率。

1.2.4 噬菌體SM1 DNA的提取及酶切分析

將單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，6 h后加入噬菌體繼續(xù)培養(yǎng)，離心收集上清液，加入PEG 8000冰浴、離心。在離心所得的噬菌體顆粒中加入蛋白酶K及SDS裂解噬菌體衣殼，釋放出核酸，抽提蛋白質(zhì)后離心收集DNA沉淀［5］。取上述噬菌體核酸溶液進(jìn)行常規(guī)酶切，于1%瓊脂糖凝膠中電泳90 V 1 h，根據(jù)酶切圖譜鑒定其核酸類型。

1.2.5 建立Sm全身感染動(dòng)物模型 挑Sm單菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至早期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將系列稀釋的Sm經(jīng)腹腔注射于5組小鼠(每組n=5)，觀察7 d，當(dāng)其中一組小鼠全部死亡的最小劑量即為100%最低致死量(minimum lethal dose，MLD)。將死亡小鼠的肺及肝組織研磨后接種至LB培養(yǎng)基，若有細(xì)菌生長(zhǎng)，用16S rRNA方法進(jìn)行菌株鑒定，若鑒定仍為Sm，則說明感染動(dòng)物模型建立成功。取2倍100%MLD為動(dòng)物感染劑量。

1.2.6 噬菌體SM1療效觀察 取2組小鼠(每組n=5)，分別用2倍100%MLD Sm菌液經(jīng)一側(cè)腹腔注射;然后，一組小鼠立即經(jīng)另一側(cè)腹腔注射噬菌體SM1液(取最佳MOI)，另一組則注射LB培養(yǎng)液作為對(duì)照，觀察7 d。

1.2.7 滅活噬菌體SM1療效觀察 將噬菌體SM1于80℃加熱30 min，行雙層瓊脂板檢測(cè)證實(shí)全部滅活。取5只小鼠，分別以2倍100%MLD菌液注射一側(cè)腹腔后，立即于另一側(cè)腹腔注射滅活噬菌體SM1。觀察小鼠存活狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體宿主范圍測(cè)定 本研究共分離出8株裂解性噬菌體，裂解率分別為 28.6%、9.5%、52.4%、14.3%、66.7%、23.8%、19% 及4.8%;其中，噬菌體 SM1的裂解率最高，為66.7%。當(dāng)噬菌體SM1與其它噬菌體混合后，其綜合裂解率可達(dá)到76.2%，因此將噬菌體SM1作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2 透射電鏡觀察噬菌體SM1 透射電鏡可見噬菌體SM1是肌尾噬菌體，由多面體的頭部和尾部組成。頭部較大，直徑約50 nm，無囊膜，尾部長(zhǎng)約70 nm(圖1)。

2.3 噬菌體SM1的最佳MOI 當(dāng)MOI=10-4時(shí)，噬菌體感染宿主菌后產(chǎn)生的子代噬菌體滴度最高(表1)，即最佳 MOI為10-4，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可根據(jù)最佳MOI進(jìn)行噬菌體的擴(kuò)增。

圖1 噬菌體SM1電鏡圖片(100000×)Fig.1 Electron micrographs of phage SM1(100000×)

表1 噬菌體SM1最佳MOI的測(cè)定Table 1 Determination of optimal MOI of phage SM1

2.4 噬菌體SM1的一步生長(zhǎng)曲線 0 min時(shí)產(chǎn)生的噬斑為1.2×105個(gè)，即為感染初期感染了噬菌體的宿主菌。根據(jù)該曲線，可以看出噬菌體感染宿主菌的潛伏期為15 min，爆發(fā)期為50 min，裂解量為187(圖2)。

2.5 細(xì)菌對(duì)噬菌體SM1的耐受突變率 將裂解至澄清的液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基再度返濁，分析為耐受噬菌體的細(xì)菌生長(zhǎng)所致。根據(jù)“終點(diǎn)滴定—返濁法”，再度返濁的最低濃度管中所含細(xì)菌數(shù)為1.7×109，該細(xì)菌含量的倒數(shù)為突變率。即細(xì)菌對(duì)噬菌體SM1的耐受突變率為6×10-10。

圖2 噬菌體SM1的一步生長(zhǎng)曲線Fig.2 One-step growth curve of phage SM1

2.6 噬菌體SM1核酸的限制性酶切電泳 使用限制性內(nèi)切酶 BamHI、EcoRI、PstⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、BglII、AatⅡ、DraⅠ、NheⅠ、SacⅠ和SaⅡ?qū)κ删w核酸進(jìn)行酶切，但僅EcoRI和XbaⅠ能夠切開基因組。由此可見，噬菌體基因組為雙鏈DNA，估計(jì)噬菌體SM1基因組大小約50 kb(圖3)。

2.7 確定100%MLD 系列稀釋的Sm菌液經(jīng)腹腔注射小鼠后，1.2×106CFU ～1.5×108CFU的菌液均可導(dǎo)致全部小鼠死亡。取死亡小鼠肺和肝組織研磨后接種LB培養(yǎng)基，可見細(xì)菌生長(zhǎng)。用16S rRNA方法鑒定該菌株仍為Sm，說明感染動(dòng)物模型建立成功。因此，腹腔注射6×106CFU的Sm菌液為引起小鼠死亡的100%MLD。

2.8 噬菌體SM1療效觀察 最佳MOI時(shí)，噬菌體SM1治療組小鼠全部存活，而對(duì)照組小鼠在48 h內(nèi)全部死亡。取對(duì)照組死亡小鼠以及治療組存活48 h及7 d小鼠的肺和肝組織送病理檢查。光鏡下對(duì)照組小鼠肺組織廣泛肺泡腔淤血，肺泡間隔毛細(xì)血管充血擴(kuò)張(圖4A1);肝組織廣泛肝血竇充血，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4B1)。而噬菌體SM1治療組小鼠48 h及7 d的肺和肝組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖4A2、3，圖4B2、3)。腹腔注射2倍100%MLD Sm菌液及滅活噬菌體SM1的5只小鼠在48 h內(nèi)全部死亡。

圖3 噬菌體SM1基因組單酶切電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of phage SM1 DNA digested with single restriction enzymes

3 討論

Sm是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，其耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，甚至到了無藥可治的地步，單方面的抗菌治療已經(jīng)難以解決這一問題。而噬菌體作為一種細(xì)菌病毒具有以下優(yōu)勢(shì):噬菌體一旦感染宿主菌后，隨著宿主菌生長(zhǎng)而表現(xiàn)為指數(shù)樣增殖，僅需很小劑量就可達(dá)到治療目的;噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性，只針對(duì)相應(yīng)的病原菌，不會(huì)引起菌群失調(diào);噬菌體的作用機(jī)制與抗生素完全不同，不受細(xì)菌耐藥性的影響;細(xì)菌不容易對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。

圖4 各組小鼠肺和肝組織HE染色結(jié)果Fig.4 Pulmonary and liver tissues in different groups

本研究以Sm為指示菌，分離出裂解譜較寬的肌尾噬菌體SM1，可形成具有典型裂解性噬菌體特征的直徑約3 mm，圓形透明的噬斑。噬菌體SM1的生物學(xué)特征為:基因組為雙鏈DNA分子，以λDNA/HindⅢ Marker為標(biāo)準(zhǔn)，推測(cè)其基因組大小約為50 kb;MOI是研究病毒感染與產(chǎn)出之間量效關(guān)系的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)，檢測(cè)最佳MOI對(duì)獲得大量的噬菌體具有意義。以不同MOI的噬菌體感染宿主菌，所得子代噬菌體的產(chǎn)量差異很大，即存在一個(gè)最佳感染復(fù)數(shù)的問題。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得噬菌體SM1對(duì)其宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)為10-4，對(duì)以后進(jìn)行噬菌體顆粒的純化、提取基因組、制備結(jié)構(gòu)蛋白均有意義;噬菌體是非細(xì)胞型微生物，從吸附宿主菌到子代噬菌體的釋放是一個(gè)爆發(fā)的過程，表現(xiàn)為“一步生長(zhǎng)曲線”。這種曲線反映的是噬菌體從吸附宿主菌，到進(jìn)入其中復(fù)制產(chǎn)生子代噬菌體，最終裂解宿主菌的過程。噬菌體SM1潛伏期(15 min)短、裂解量(187)大，能夠更快速和更高效的殺滅菌主菌，因此具有較好的臨床應(yīng)用前景;本研究中還發(fā)現(xiàn)，裂解澄清的菌液在繼續(xù)培養(yǎng)過程中再次返濁，這可能是敏感宿主菌被裂解后，由突變的耐受菌所取代的一種“菌群交替”現(xiàn)象。究其原因可能是實(shí)驗(yàn)中使用的宿主菌量太大，超過了產(chǎn)生耐受突變的概率。那么細(xì)菌對(duì)噬菌體突變的概率是多少?噬菌體能作為治療制劑嗎?因?yàn)槭删w制劑的制備速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上細(xì)菌發(fā)生耐受的速度。本研究中細(xì)菌對(duì)噬菌體SM1的突變率為6×10-10，低于細(xì)菌對(duì)抗生素的自然突變率(10-6～10-9)。說明菌株Sm的耐噬率遠(yuǎn)低于對(duì)抗生素的耐藥率。細(xì)菌耐受噬菌體的原因包括吸附抑制、流產(chǎn)感染、限制修飾、穿入阻滯、噬菌體編碼的噬菌體抵抗作用以及基因工程修飾等［6-7］。

本研究以最佳MOI的噬菌體SM1液治療全身性Sm感染的小鼠，結(jié)果顯示治療組小鼠全部存活，病理切片上見小鼠的正常組織結(jié)構(gòu)完好，表明噬菌體對(duì)于Sm感染具有良好的療效。相反滅活噬菌體SM1治療組小鼠在48 h內(nèi)卻全部死亡，說明噬菌體裂解細(xì)菌的作用并不依賴于某種非特異的免疫反應(yīng)，而可能與噬菌體中裂解酶及穿孔素破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁有關(guān)。

本研究使用的指示菌來源于臨床菌株，噬菌體也是從醫(yī)院污水中分離得到，對(duì)臨床抗感染治療具有實(shí)用性。噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性，只能裂解一種或者是一株細(xì)菌，這種特性雖然可避免破壞人體內(nèi)的正常菌群結(jié)構(gòu)以及二重感染的發(fā)生，但也導(dǎo)致患者感染某種細(xì)菌后無法快速的確定此細(xì)菌的株系，也就無法選擇特異性的噬菌體，限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此，本研究將不同宿主譜的噬菌體混合在一起聯(lián)合用藥來擴(kuò)大其宿主范圍。本實(shí)驗(yàn)中單株噬菌體SM1裂解率為66.7%，聯(lián)合裂解譜較寬的噬菌體后，其裂解率可達(dá)到76.2%，擴(kuò)大了噬菌體的宿主范圍。接下來的研究中，還需篩選更多的Sm噬菌體制成“雞尾酒”復(fù)合制劑，拓寬噬菌體裂解譜、降低交叉耐噬率、增強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)以及減輕毒副反應(yīng)［8］。

綜上所述，噬菌體SM1具有使用劑量小、起效迅速、殺菌作用強(qiáng)、耐噬率低、裂解譜較寬等特點(diǎn)，可快速有效地治療實(shí)驗(yàn)小鼠的Sm全身感染，這為我們提供了一個(gè)新的治療途徑。

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