兒童外周血造血干細(xì)胞采集方法與效果評(píng)價(jià)

殷國美，沈卓嵐，秦 斐，錢文斌

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，浙江杭州 310003;2.浙江省血液中心，浙江杭州 310006）

自體和異基因外周血造血干細(xì)胞移植(peripheralblood stem celltransplantation，PBSCT)由于造血干細(xì)胞采集方便、不需要全身麻醉、移植后造血重建快等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于惡性血液病與部分實(shí)體腫瘤等疾病的治療［1-6］。對(duì)于兒童 PBSCT，由于其年齡小、體重輕、循環(huán)血量少，易發(fā)生枸櫞酸中毒反應(yīng)和容量異常反應(yīng)等;特別是體重＜20 kg的小兒，在外周血造血干細(xì)胞(PBSC)采集時(shí)，還需要維持血液分離過程中的血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，采集更加困難。浙江省血液中心自2004年10月至今，成功采集兒童外周血造血干細(xì)胞31例，現(xiàn)就兒童PBSC的采集方法與效果作一介紹。

1 材料和方法

1.1 病例 2004年10月至2012年4月間，浙江省血液中心采集兒童外周血造血干細(xì)胞共31例(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院3例，浙江省腫瘤醫(yī)院5例，浙江省兒童醫(yī)院23例)。其中，男15例、女16例，中位年齡10歲(1.4～17歲)。本組病例中自體PBSCT 20例，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)2例，原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性單核細(xì)胞白血病(AMoL)和急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)各1例，慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)3例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)11例;同種異體PBSCT 11例，受者為CML 2例、ALL 2例、再生障礙性貧血(AA)2例、急性粒-單核細(xì)胞白血病(AMMoL)4例、AMoL 1例，供者為異體健康供者，11例中除1例為父子間的半相合移植，其余10例為同胞供者移植。

1.2 儀器 CS-3000 Plus血細(xì)胞分離機(jī)(美國Baxter公司)，包括普通分離槽和小體積收集槽、小體積分離槽和小體積收集槽;6.1版本軟件的 COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)(美國Caridian BCT公司);COM TEC血細(xì)胞分離機(jī)(美國Fresenius kabi公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBSC動(dòng)員 ①自體:采用化療和 GCSF或GM-CSF動(dòng)員，化療后WBC數(shù)下降至低谷并開始回升時(shí)給予G-CSF或GM-CSF 3～5μg/kg，皮下注射，1次/d，待 WBC數(shù)回升至 ＞5.0×109/L時(shí)，進(jìn)行PBSC采集。②異體:單用G-CSF 5 ～10μg/kg，1 次/d，皮下注射，連用5 d后開始采集PBSC。

1.3.2 單采儀器的選擇 對(duì)于體重 ＞30 kg，紅細(xì)胞壓積(HCT)＞24%的小兒，可選用3種分離機(jī)中的任何一種進(jìn)行采集(全血流速為10～50 ml/min);對(duì)于體重﹤ 30 kg、HCT ＞24%或者體循環(huán)(TBV)＞1650 ml的小兒，可選用CS-3000 Plus(小體積分離槽和小體積收集槽)或COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)低流速分離(全血流速為10～30 ml/min);對(duì)于體重＜20 kg，HCT﹤24%或者TBV≤1100～1650 ml的小兒，先用經(jīng)過25 Gy γ射線照射的同型少白細(xì)胞紅細(xì)胞1 U充盈分離管路，再選用3種分離機(jī)中的任何一種血細(xì)胞分離機(jī)低流速分離。

1.3.3 PBSC采集 對(duì)于體重﹤30 kg的小兒，使用小體積分離槽和小體積收集槽，選擇兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)收集程序(預(yù)設(shè)Specil8程序)，全血流速為10～30 ml/min。對(duì)于體重﹤20 kg小兒，HCT﹤24%時(shí)，初始化后用經(jīng)過25 Gy γ射線照射的同型少白細(xì)胞紅細(xì)胞1 U充盈分離管路［10］。根據(jù)小兒 HCT、MNC計(jì)數(shù)修改地址68和71的內(nèi)容，設(shè)定循環(huán)血量為2～3倍TBV。采集在第一次溢出結(jié)束時(shí)設(shè)定界面探測值基線(IDB)，收集終產(chǎn)品約50 ml。

1.3.4 使用6.1版本軟件的 COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)和雙級(jí)充填盤 按照采集液流徑指示膜安裝AutoPBSC管路，初始化后輸入患兒的身高、體重、HCT、WBC 計(jì)數(shù)、MNC%，設(shè)定循環(huán)血量為患兒TBV的2～3倍，全血流速10～45 ml/min。采集PBSC的收獲量3～5 ml，追趕量為3～7 ml，設(shè)定合適的收獲次數(shù)，產(chǎn)品終體積為(收獲量+追趕量)×收獲次數(shù)。如果系統(tǒng)的體外環(huán)路容量超過患兒TBV的10%～15%或者患兒TBV≤1100～1650 ml，需要增加血液預(yù)注，方法同前。本方法采集的18例中，有2例體重分別為17 kg、18 kg，采用了血液預(yù)注和低流速分離，維持了患兒分離過程的血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。

1.3.5 使用COM TEC血細(xì)胞分離機(jī) 選擇autoMNC(P1YA)程序和配套分離盤，安裝P1YA耗材并初始化，輸入患兒各項(xiàng)參數(shù)(包括采集前CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù))，初始時(shí)白膜泵出菜單(每循環(huán)全血量、白膜泵出量、白膜收集量、循環(huán)次數(shù))和過程參數(shù)菜單(血流量、抗凝劑比例、離心機(jī)轉(zhuǎn)速)均顯示機(jī)器自動(dòng)設(shè)置值和默認(rèn)值，采集過程中觀察離心腔內(nèi)白膜形成情況，在第3個(gè)循環(huán)開始時(shí)再根據(jù)白膜厚度(2 mm較為適宜)和質(zhì)地調(diào)節(jié)每循環(huán)全血量，在分離過程中每處理3000 ml全血再增加20 ml，白膜泵出量自體15 ml、異體25 ml，白膜收集量自體4～7 ml、異體 7 ～10 ml，全血流速 10 ～50 ml/min，當(dāng)HCT﹤24%時(shí)，全血流速要控制在40 ml/min以內(nèi)。體重﹤30 kg時(shí)，在采集開始階段，先用紅細(xì)胞充管路(方法同前)，速度從10 ml/min開始，最高不超過30 ml/min。本方法采集3例，其中2例異體健康供者，體重＞30 kg，均一次采集成功。

1.3.6 抗凝劑 ACD-A與全血比例 兒童對(duì)ACD-A較為敏感，較易發(fā)生枸櫞酸鹽中毒，在分離過程中ACD-A與全血比例應(yīng)控制在1∶10～1∶13，采集過程中密切觀察兒童有無口周及四肢麻木、惡心、抽搐等枸櫞酸鹽中毒表現(xiàn)，如有發(fā)生要及時(shí)處理。采集前和采集中給予10%葡萄糖酸鈣10 ml口服，預(yù)防低鈣血癥發(fā)生。

1.3.7 檢測指標(biāo) 自動(dòng)員起至采集結(jié)束，每天檢測供者外周血血常規(guī)和MNC。應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測動(dòng)員前后及采集產(chǎn)品CD34+數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以表示，相關(guān)性分析采用線性回歸，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)員與采集效果 使用CS-3000 Plus血細(xì)胞分離機(jī)普通分離槽和小體積收集槽采集8例，使用小體積分離槽和小體積收集槽采集2例;6.1版本軟件的COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)采集18例;COM TEC血細(xì)胞分離機(jī)采集3例。本組31例均采集成功，采集次數(shù)1～5次，平均1.5 次，獲得 CD34+細(xì)胞數(shù)(7.9 ±2.9)×106/kg，MNC(7.4 ±3.1)×108/kg(表 1)。在采集過程中供者和患者均未出現(xiàn)麻木、嘔吐等并發(fā)癥。

2.2 CD34+細(xì)胞數(shù)和采集循環(huán)血量及MNC的相關(guān)性 31例PBSC采集產(chǎn)品中收獲的CD34+數(shù)量和MNC數(shù)、循環(huán)血量呈正相關(guān)(圖1、2)。

3 討論

3.1 兒童外周血造血干細(xì)胞采集的有效性

異體和自體PBSC能恢復(fù)衰竭的骨髓造血功能，已成為干細(xì)胞移植的主要來源。然而，能否成功采集到足夠數(shù)量的外周血干細(xì)胞是移植成功的前提和關(guān)鍵。文獻(xiàn)報(bào)道，兒童PBSCT所需CD34+數(shù)最低為 2.0 ×106/kg，理想目標(biāo)是 5.0×106/kg［7］。從本組 31 例兒童患者/供者采集結(jié)果看，經(jīng)G-CSF動(dòng)員后，于d 5用血細(xì)胞分離機(jī)采集 PBSC，采集物中 CD34+細(xì)胞數(shù)達(dá)到(7.9 ±2.9)×106/kg，MNC 為(7.4 ±3.1)×108/kg，能滿足 PBSCT所需求的 CD34+細(xì)胞數(shù)/kg 體重(2.0 ～5.0)×106［8-9］。Richard 等報(bào)道，兒童患者平均輸入6.0×106/kg的CD34+細(xì)胞，其中性粒細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間與CD34+細(xì)胞數(shù)無相關(guān)性，但血小板恢復(fù)到 50000/mm3在CD34+細(xì)胞 ＜4.0×106/kg和 ＞4.0×106/kg

組之間有差別。本組兒童最低CD34+細(xì)胞數(shù)為4.2×106/kg，臨床移植均獲得成功，說明我們的采集方法和程序是十分有效的。

表1 外周血干細(xì)胞動(dòng)員與采集效果Table 1 Mobilization and collection efficiency of PBSCs

圖1 CD34+細(xì)胞數(shù)與患者/供者采前MNC數(shù)的關(guān)系Fig.1 Relationship between CD34+cell count per component and MNCs before apheresis

圖2 CD34+細(xì)胞數(shù)與循環(huán)血量的關(guān)系Fig.2 Relationship between CD34+cell count per component and processed volume

3.2 兒童外周血造血干細(xì)胞采集的影響因素本研究結(jié)果顯示:①采集物中CD34+與患者/供者采前MNC計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，提示采前外周血中相對(duì)高的MNC可獲得較多的CD34+細(xì)胞。本組 31例經(jīng) G-CSF動(dòng)員后，d 5采集PBSC，平均采集1.5次;其中20例1次采集即可獲得移植所需求的CD34+細(xì)胞，表明我們的動(dòng)員方案是合適的。②采集效果與采集的循環(huán)血量呈正相關(guān)，考慮到采集時(shí)體外血量大于全身血量(75 ml/kg)的10% ～15%，容易出現(xiàn)低血容量綜合征［10］;同時(shí)，回輸氯化鈉溶液會(huì)使體內(nèi)HCT發(fā)生變化，影響 PBSC的采集效果。為此，體重＜20 kg的患兒，在初始化完成后再給予輻照同型的少白細(xì)胞、紅細(xì)胞懸液的預(yù)先充盈管路，使患兒體內(nèi)血液容量保持穩(wěn)定;這樣能夠保證兒童PBSC采集時(shí)的采集循環(huán)血量。③兒童對(duì)抗凝劑較為敏感，如采集過程中血鈣偏低，較易發(fā)生枸櫞酸鈉中毒，主要表現(xiàn)為口角麻木、心慌、氣短、眩暈、嘔吐、呼吸困難及穿刺處血腫、感染等。本組通過緩解供者緊張心理，將抗凝劑與全血比例維持在1∶10～1∶13之間，減少枸櫞酸鈉的輸入量，采集前常規(guī)口服葡萄糖酸鈣，采集中視供者狀況口服葡萄糖酸鈣，均未出現(xiàn)枸櫞酸中毒及其他不良反應(yīng)。

［1］MOOG R.Peripheral blood stem cell collection in children:Management，techniques and safety ［J］.Transfus Apher Sci，2010，43(2):203-205.

［2］BRAUNINGER S，BIALLECK H，SEIFRIED E，et，al.Asystole during stem cell apheresis in a young healthy female volunteer donor［J］.Transfusion，2011，51(7):1594-1595.

［3］KIM J W，LEE H J，YI HG，et al.Mitoxantrone，etoposide，cytarabine，and melphalan(NEAM)followed by autologous stem cell transplantation for patients with chemosensitive aggressive non-Hodgkin lymphoma ［J］.Am J Hematol，2012，87(5):479-483.

［4］BRAUNINGER S，BIALLECK H，THORAUSCH K，et al.Mobilized allogeneic peripheral stem/progenitor cell apheresis with spectra optia V5.0，a novel，automatic interface-controlled apheresis system:results from the first feasibility trial［J］.Vox Sang，2011，101(3):237-246.

［5］REINHARDT P，BRAUNINGER S，BIALLECK H，et，al.Automatic interface-controlled apheresis collection of stem/progenitor cells:results from an autologous donor validation trial of a novel stem cell apheresis device［J］.Transfusion，2011，51(6):1321-1330.

［6］COOLING L，HOFFMANN S，HERRST M，et，al.A prospective randomized trial of two popular mononuclearcellcollection setsforautologous peripheral blood stem cell collection in multiple myeloma［J］.Transfusion，2010，50(1):100-119.

［7］WOREL N，PETERS C，GERHARTL K，et al.Collection of peripheral blood stem cells(PBSC)after chemotherapy and administration of rhGM-CSF in children weighing less than 17 kg［J］.Transfus Sci，1996，17(4):601-606.

［8］KORETH J，CULTER C S，DJULBEGOVIC B，et al.High-does therapy with single autologous transplantation versus chemotherapy diagnosed multiple myeloma:A systematic review and metaanalysis of randomized controlled trials［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2007，13(2):183-196.

［9］HARRIS R E，TERMUHLEN A M，SMITH L M，et al.Autologous peripheral blood stem cell transplantation in children with refractory or relapsed lymphoma:results of Children's Oncology Group study A5962 ［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(2):249-258.

［10］CECYN K Z，SEBER A，GINANI V C，et al.Large-volume leukapheresis for peripheral blood progenitor cellcollection in low bodyweight pediatric patients:a single center experience ［J］.Transfus Apher Sci，2005，32(3):269-274.