戚雨婷，張麗君，趙 翔，張 頁*

多種人工合成的查爾酮以及來自藥用植物與食物的查爾酮和醌類天然產(chǎn)物，均有顯著的抗癌、防癌活性［1－2］。靛紅是存在于中藥青黛中的芳香酮類化合物，也是人體中的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒及神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性［3］。靛紅衍生物結(jié)構(gòu)多樣，生物活性高，在靶向藥物研發(fā)領(lǐng)域有很大發(fā)展?jié)摿Γ?］。本實(shí)驗(yàn)室將查爾酮與靛紅拼接整合，合成了鄰硝基苯基靛紅查爾酮(o-nitrobenzylisatinyl chalcone，ONIC)。本實(shí)驗(yàn)研究了ONIC單用和與多種已知抗癌藥和通路抑制劑聯(lián)用的抗癌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7，人鼻咽癌細(xì)胞 CNE，人肺癌細(xì)胞 NCI-H460和A549(本實(shí)驗(yàn)室液氮罐中保存)。人直腸癌細(xì)胞HCT-116和小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1(上海中科院細(xì)胞所)。DMEM及 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)。特級(jí)胎牛血清(北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。17-AAG、Brefeldin A(布雷菲德菌素A，BFA)、U0126、LY294002 和 Rapamycin(雷帕霉素)(LC Laboratories公司)，Paclitaxel(紫杉醇)、Fasudil(法舒地爾)和Bortezomib(硼替佐米)(大連美侖生物技術(shù)公司)，NSC23766(SantaCruz公司)，Metformin(甲福明，即二甲雙胍)(北京偶合科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將腫瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))、80 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 DMEM(或RPMI-1640)培養(yǎng)基、在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度IC50的測(cè)定

用酸性磷酸酶(acid phosphatase assay，APA)法檢測(cè)ONIC作用48 h后的存活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，并計(jì)算細(xì)胞存活百分率(cell viability，Cv)和半數(shù)抑制濃度 IC50(50%inhibition concentration)［5－6］。

1.4 ONIC與已知抗癌藥或通路抑制劑聯(lián)用的效果

聯(lián)合用藥配伍方式:1)將ONIC與藥物按一定摩爾比混合后，再用培養(yǎng)液倍比稀釋;2)用含固定濃度藥物的培養(yǎng)液倍比稀釋ONIC;3)用含固定濃度ONIC的培養(yǎng)液倍比或4倍稀釋藥物。分別將按上述3種方式稀釋的配伍藥劑作用于96孔板中培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，并以O(shè)NIC和各藥單獨(dú)作用于細(xì)胞為對(duì)照。用APA法測(cè)算Cv。藥物效應(yīng)值E、或受累細(xì)胞分?jǐn)?shù)Fa(fraction affected)即增殖抑制率可按下式求得:

上述第1種配伍采用Chou氏法［7］聯(lián)合用藥分析軟件Calcusyn 2.0，將聯(lián)用時(shí)、以及ONIC與各藥單用時(shí)各濃度下的Fa值代入軟件，計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)CI(combination index)，CI＜1兩藥為協(xié)同，CI=1兩藥為疊加，CI＞1兩藥為拮抗。用棱鏡軟件繪制聯(lián)用時(shí)的Fa-CI曲線。兩藥摩爾比的選取以兩藥IC50比值為參考，即ONIC和各藥均取約4倍IC50值為起始濃度，混合后進(jìn)行倍比稀釋。

上述第2、3種配伍用金正均法計(jì)算聯(lián)合用藥的效應(yīng)-概率和比值 Q［8］:

上式中分子Ea+b為A和B兩藥聯(lián)用的效應(yīng)值;分母為疊加概率和，其中Ea和Eb分別為A藥(ONIC)和B藥在相同濃度下單用的效應(yīng)值。當(dāng)Q=1、并以±0.15為可信區(qū)間，即Q在0.85～1.15時(shí)，兩藥疊加;當(dāng)Q＞1.15，兩藥協(xié)同;當(dāng)Q＜0.85，兩藥拮抗。用棱鏡軟件繪制劑量-Q值曲線。選取存活率約70%、即增殖抑制效應(yīng)E值約0.3的ONIC或藥物濃度為固定值［9］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ONIC的體外抗腫瘤活性

ONIC對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞和4種其他腫瘤細(xì)胞均有強(qiáng)抗癌活性。其中4T1、MDA-MB-231、MDAMB-468、HCT-116和 CNE細(xì)胞對(duì)藥物敏感性強(qiáng)，MCF-7、NCI-H460和A549細(xì)胞敏感性稍弱(表1)。

2.2 ONIC與藥物聯(lián)合作用于乳腺癌細(xì)胞的抗癌效果

2.2.1 ONIC與藥物按恒定摩爾比稀釋的聯(lián)用效果:ONIC與17-AAG、或ONIC與BFA單獨(dú)及聯(lián)合作用于 MDA-MB-231細(xì)胞的 Cv曲線如圖1，按Chou氏法繪制的Fa-CI曲線如圖2，圖2A和圖2B中的箭頭對(duì)應(yīng)于相同的數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖1A中箭頭顯示ONIC與17-AAG聯(lián)用的Cv值比ONIC或17-AA單用均顯著降低(p＜0.001)，此點(diǎn)的聯(lián)用指數(shù)CI=0.603，即有協(xié)同作用(圖2A)。圖1B中箭頭顯示兩種濃度ONIC與BFA聯(lián)用的Cv值均比單獨(dú)給藥有極顯著降低(p＜0.001)，此兩點(diǎn)的CI值分別為0.624和0.725，均有協(xié)同作用(圖2B)。

表1 ONIC作用于8種癌細(xì)胞系的IC50值Table 1 The IC50 values of ONIC on eight cancer cell lines，n=6)

表1 ONIC作用于8種癌細(xì)胞系的IC50值Table 1 The IC50 values of ONIC on eight cancer cell lines，n=6)

cell line IC50(mg/L)1 mouse breast cancer cell line 4T1 2.1±2.5 2 human breast cancer cell line MDA-MB-231 3.1±2.5 3 human breast cancer cell line MDA-MB-468 3.4±2.6 4 human breast cancer cell line MCF-7 4.6±2.5 5 human colorectal cancer cell line HCT-116 1.9±2.5 6 human nasopharyngeal cancer cell line CNE 2.4±2.6 7 human lung cancer cell line NCI-H460 5.2±2.6 8 human lung cancer cell line A549 9.1±2.5

2.2.2 藥物和ONIC濃度恒定的聯(lián)用效果:在7種藥物濃度恒定時(shí)，雷帕霉素、17-AAG、U0126與ONIC聯(lián)用有明顯協(xié)同;NSC23766或紫杉醇與ONIC之間只有疊加;甲福明和LY294002與ONIC均為拮抗(圖3A)。ONIC濃度恒定時(shí)，ONIC與17-AAG或硼替佐米均為協(xié)同，但與法舒地爾為拮抗(圖3B)。

圖3 ONIC與抑制劑聯(lián)用時(shí)的劑量-Q值曲線Fig 3 The dosage-Q plots for combination of ONIC and inhibitors

3 討論

ONIC對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞有廣譜抗癌效果。應(yīng)用Chou氏和金氏法分析了ONIC與10種藥物的聯(lián)用效果。Chou氏法在國(guó)際上廣泛應(yīng)用，其軟件適用于按恒定摩爾比稀釋的兩種聯(lián)用藥物的效果判定，且Chou氏法要求藥A與藥B對(duì)癌細(xì)胞均有顯著殺傷作用;本研究ONIC有顯著抗癌作用，與有強(qiáng)抗癌活性的藥物如17-AAG和BFA聯(lián)用，滿足Chou氏法的上述要求。但許多抑制劑如U0126、NSC23766、甲福明、LY294002在其靶標(biāo)特異性劑量范圍內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞無明顯殺傷，無法用Chou氏法計(jì)算CI［7］;此時(shí)固定抑制劑濃度即可用金氏法獲得Q值并判斷效果(圖3A)。

在10種藥物中，紫杉醇和NSC23766與ONIC有疊加作用，即二者的作用途徑與ONIC互不干擾。紫杉醇可阻止微管解聚并阻斷有絲分裂，但并不影響ONIC的抗癌活性，提示ONIC并非通過干擾微管或有絲分裂發(fā)揮作用。Ras-Rac1通路過度活化可引發(fā)巨胞飲和鴆亡［10］，NSC23766為 Rac1的抑制劑，但并不拮抗ONIC，提示ONIC并非作用于Rac1上游。與ONIC協(xié)同的藥物有5種:HSP90抑制劑17-AAG、Arf抑制劑 BFA［11］、蛋白酶體抑制劑硼替佐米、mTOR抑制劑雷帕霉素、ERK1/2抑制劑U0126。17-AAG、BFA、硼替佐米均可能破壞囊泡的穩(wěn)定性，從而強(qiáng)化ONIC的抗癌效果。與ONIC拮抗的藥物有3種:RhoA抑制劑法舒地爾、PI3K抑制劑LY294002、LKB1-AMPK激動(dòng)劑甲福明。法舒地爾的拮抗作用提示ONIC可活化RhoA通路。LY294002、甲福明、雷帕霉素均可抑制mTOR活化［12］，但前二者與ONIC拮抗、后者則為協(xié)同，提示ONIC對(duì)mTOR的上、下游通路有關(guān)鍵作用?？傊瑢?duì)ONIC抗癌活性及聯(lián)合用藥特性的揭示，將有助于基于新靶標(biāo)的抗癌藥研發(fā)。

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