王 鵬，朱爭艷，李成龍，駱 瑩，張海鵬，劉 輝

EphA2是一種受體酪氨酸蛋白激酶，可通過與其配體EphrinAl結合，導致自身及下游底物蛋白的酪氨酸磷酸化，引起一系列生物學效應，參與正常細胞的生長、增殖及轉化［1］。研究發(fā)現，EphA2受體在多種腫瘤中高表達，這些癌細胞的生長、分化與EphA2的過表達密切相關［2－3］。肝細胞癌(hepatocellular carcinorma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿、進展快、惡性度高，易發(fā)生侵襲和轉移，傳統(tǒng)治療的效果均不甚理想［4］，探討HCC的發(fā)病及惡化機制，對降低HCC患者的病死率將具有重要意義。因此，本實驗通過檢測正常肝細胞系及兩種肝癌細胞系中EphA2蛋白的表達，探討其與肝細胞增殖、凋亡的關系，并通過癌細胞中HBV DNA的定量檢測，分析EphA2表達與HBV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人正常肝細胞系HL7702及人肝癌細胞系HepG2、HepG2.2.15(中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所提供)。EphA2(clone C-20)兔抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司)，免疫組化二抗試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)。HBV DNA定量檢測試劑盒(北京達安基因有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將3種細胞系置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素 100 U/L、鏈霉素 100 g/mL)中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細胞處于對數增殖期時，進行傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫化學染色

取各組細胞爬片，用4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，加入3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗，羊血清室溫封閉。滴加EphA2一抗工作液(1∶100稀釋)，4℃過夜，滴加二抗工作液(1∶200稀釋)，室溫孵育30 min，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉卵白素，室溫孵育30 min，PBS沖洗后，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照以 PBS液代替一抗。每張切片隨機選擇200倍視野，經圖像分析系統(tǒng)(BioMias，四川大學)測定各組陽性細胞面積。

1.4 Western blot檢測

提取細胞總蛋白，經蛋白定量后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脫脂奶粉的Tris-HCl溶液(TBS)中封閉2 h，加入EphA2一抗工作液，4℃過夜。TBS洗膜后，加入二抗工作液，37℃孵育1.5 h，TBS洗膜，加入HRP標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1 h，TBS洗膜，采用DAB法顯色，結果以目的條帶與內參條帶(β-actin)吸光度的比值表示。

1.5 流式細胞術(FCM)檢測

制備單細胞懸液，調整細胞數為1×106個/mL，加入DNA染液，4℃下染色30 min，以500目篩網過濾，上機檢測。激發(fā)波長488 nm，以凋亡率表示凋亡狀態(tài)，利用DNA組方圖各時相分布的百分比，用增殖指數(proliferation index，PI)表示細胞的增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)，每組實驗重復3次。

1.6 HBV DNA含量測定

采用熒光定量PCR法檢測兩種肝癌細胞中HBV DNA的含量，按照試劑盒說明書操作。目標基因mRNA根據標準曲線得出mRNA的分子拷貝數。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 EphA2在各組細胞中的表達

EphA2蛋白陽性表達于胞質與胞膜中，呈棕黃色顆粒，與正常肝細胞中EphA2的染色面積比較，兩種肝癌細胞中EphA2的平均吸光度值(累積吸光度值/染色面積，IA/area)顯著增大(p＜0.05)，且HepG2.2.15細胞中EphA2的平均吸光度值顯著高于HepG2中EphA2的平均吸光度值(p＜0.01)(圖1)。Western blot結果顯示，與正常肝細胞中EphA2蛋白的表達量比較，兩種肝癌細胞中E-phA2蛋白的表達量均顯著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15細胞中EphA2蛋白的表達量顯著高于HepG2細胞中EphA2蛋白的表達量(p＜0.01)(圖2)。

圖1 各實驗組細胞中EphA2的免疫細胞化學染色結果Fig 1 The EphA2 expression of 3 groups(immunocytochemical staining，×400)

2.2 各組細胞的增殖指數與凋亡率

與正常肝細胞的增殖指數比較，兩種肝癌細胞的增殖指數均顯著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15細胞的增殖指數顯著高于HepG2細胞的增殖指數(p＜0.01)(表1);與正常肝細胞的凋亡率比較，兩種肝癌細胞的凋亡率均顯著降低(p＜0.01)，且HepG2.2.15細胞的凋亡率顯著低于HepG2細胞的凋亡率(p＜0.01)(表1，圖3);肝細胞的增殖指數與EphA2表達呈顯著的正相關(p＜0.01)，肝細胞的凋亡率與EphA2表達呈顯著的負相關(p＜0.01)(圖4)。

2.3 肝癌細胞中HBV DNA的含量

圖2 各實驗組細胞中EphA2的Western blot結果Fig 2 The EphA2 protein expression of three groups

HepG2細胞中 HBV為陰性表達(－)，HBV DNA的含量均為0拷貝/mL;而HepG2.2.15細胞中HBV為陽性表達(+)，HBV DNA的含量均大于1×106拷貝/mL;肝癌細胞中 HBV DNA水平與EphA2的表達量呈顯著正相關(r=0.878，p＜0.05)(表2)。

表1 各實驗組細胞的增殖指數與凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

表1 各實驗組細胞的增殖指數與凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

*p＜0.01 compared with HL7702;#p＜0.01 compared with HepG2．

group proliferation index apoptotic ratio HL7702 cell line 30.11±0.18 0.311±0.042 HepG2 cell line 32.01±0.16* 0.169±0.013*HepG2.2.15 cell line 34.83±0.28*# 0.103±0.005*#

表2 肝癌細胞中HBV DNA水平與EphA2的表達相關性分析Table 2 The correlation between the expression of EphA2 protein and HBV DNA level

3 討論

EphA2是一種受體酪氨酸蛋白激酶，在生理條件下以低水平廣泛表達于各種上皮細胞中，參與細胞的生長、增殖及轉化等。研究發(fā)現，EphA2受體在多種腫瘤中高表達，這些癌細胞的生長、分化與EphA2的過表達密切相關［2－3］。EphA2 有望成為一個理想的腫瘤標志物，對多種腫瘤的診斷、治療及預后判斷具有重要的臨床意義，但關于EphA2在腫瘤發(fā)生及惡性進展中的分子調控機制還需進一步深入研究。

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其患病人數正在逐年遞增。中國是HCC的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占全球肝癌患者的55%［5］。HCC發(fā)病隱匿、進展快、惡性程度高，易發(fā)生侵襲和轉移，傳統(tǒng)治療的效果均不甚理想，探討HCC的發(fā)病及惡化機制將具有重要意義。研究發(fā)現，EphA2在肝癌組織中過表達，可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關［6－7］。因此，本實驗檢測了正常肝細胞系及兩種肝癌細胞系中E-phA2蛋白的表達情況，并探討其與肝細胞增殖、凋亡的關系。結果發(fā)現，與正常肝細胞比較，兩種肝癌細胞中 EphA2蛋白的表達水平均顯著升高，且EphA2蛋白的異常高表達，可促進肝細胞的惡性生長，抑制肝細胞的生理凋亡，提示EphA2蛋白的過表達在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

研究發(fā)現，乙肝病毒(HBV)感染是引起HBV相關性HCC發(fā)病的重要誘因［8］。因此，EphA2蛋白在HCC中的過表達可能與HBV感染具有一定的相關性。本實驗通過兩種肝癌細胞系中HBV DNA的定量檢測，分析EphA2表達與HBV感染的相關性，結果發(fā)現HepG2.2.15細胞中HBV DNA水平顯著高于HepG2細胞中HBV DNA水平，且HepG2.2.15細胞中EphA2蛋白的表達水平顯著高于HepG2細胞中EphA2蛋白的表達水平，HBV DNA水平與E-phA2表達量呈顯著正相關，提示在肝癌細胞中E-phA2蛋白的異常高表達與HBV感染密切相關。

［1］Giannoni E，Taddei ML，Parri M，et al．EphA2-m ediated mesenchyma l-amoeboid transition induced by endoth elial progenitor cells enhanc es metastatic spread due to cancerassociated fibroblasts ［J］． J Mol Med，2013，91:103－115．

［2］Hou FT，Yuan WJ，Huang J，et al．Overexpression of E-phA2 correlates with epithelial-mesenchymal transition-related proteins in gastric cancer and their prognostic importance for postoperative patients［J］．Med Oncol，2012，29:2691－2700．

［3］Liu Y，Yu CY，Qiu YZ，et al．Downregulation of EphA2 expression suppresses the growth and metastasis in squamous-cell carcinoma of the head and neck in vitro and in vivo［J］．JCancer Res Clin Oncol，2012，138:195 －202．

［4］Su S，Zhou H，Xue M，et al．Anti-tumor efficacy of a hepatocellular carcinoma vaccine based on dendritic cells combined with tumor-derived autophagosomes in murine models［J］．Asian Pac JCancer Prev，2013，14:3109 －3116．

［5］EI-Serag HB，Rudolph KL．Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］．Gastroenterology，2007，132:2557－2576．

［6］Yang P，Yuan W，He J，et al．Overexpression of EphA2，MMP-9，and MVD-CD34 in hepatocellular carcinoma:Implications for tumor progression and prognosis［J］．Hepatol Res，2009，39:1169 －1177．

［7］Cui XD，Lee MJ，Yu GR，et al．EFNA1 ligand and its receptor EphA2:potential biomarkers for hepatocellular carcinoma［J］．Int J Cancer，2010，126:940 －949．

［8］Dimitroulis D，Valsami S，Spartalis E，et al．Hepatocellular carcinoma in patients co-infected with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus ［J］．World J Hepatol，2013，5:323－327．