桂 玲，王 靜，祝愛珍，劉成成，劉革修*

NAC-1(nucleus accumbens-1，Nac1 or NAC-1)是一干細胞多能性因子，屬于BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與一些核蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)活性，參與胚胎干細胞的自我更新和多能性分化。研究顯示卵巢癌細胞表達NAC-1與其紫杉醇耐藥相關(guān)［1－2］。靶向NAC-1基因的 siRNA 能抑制卵巢癌HO8910細胞生長［3］。但是，NAC-1調(diào)節(jié)卵巢癌細胞生長的機制還不清楚。大量研究顯示，Wnt/β-catenin信號途徑在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用，而異常表達或激活則與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4－5］。所以，本研究分析了NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞Wnt/β-catenin信號途徑及其下游靶基因cyclin D1和survivin基因表達的影響，以了解NAC-1在卵巢癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人卵巢癌細胞系HO8910(中國科學(xué)院上海細胞生物研究所)，由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖研究室保存;RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程科技有限公司);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅠMix試劑盒(Tiangen公司)、MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學(xué)發(fā)光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);以NAC-1基因為靶標的特異性siRNA和陰性對照siRNA。

1.2 靶向NAC-1基因寡核苷酸的設(shè)計

采用桂玲等［3］前期研究的NAC-1基因特異性siRNA 序 列:5'-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3'，陰性對照序列為 5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'，均由廣州市銳博生物科技有限公司合成及純化。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將人卵巢癌細胞系HO8910細胞以1×106個/孔接種于6孔板，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于CO2體積分數(shù)為5%的37℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細胞生長至70%匯合時，參考試劑盒說明書，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染各種siRNA(50 nmol/L)。實驗分組:空白對照(control)組、陰性 siRNA(negative siRNA)組和NAC-1 siRNAs組。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性

［3］。

1.5 克隆形成實驗檢測干細胞特性

見參考文獻［3］。

1.6 FCM法檢測細胞周期

見參考文獻［3］。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測mRNA表達

siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，提取總RNA、并用紫外分光光度計定量，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板、NAC-1基因特異性引物進行實時熒光定量PCR分析，根據(jù)2－△△Ct方法分析目的基因的mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers in real time PCR

1.8 Western印跡法檢測

收集細胞提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白50μg上樣，進行12%聚丙烯酰胺凝膠，120 V恒壓電泳1 h，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。然后，用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入鼠抗人 NAC-1(1∶200)、β-catenin 抗體(santa Cruz)、cyclin D1抗體、survivin抗體、p-LRP6(Ser1490)抗體(cell signaling)或兔抗人GAPDH抗體于4℃孵育過夜(sigma，1∶4 000)，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標志的相應(yīng)二抗IgG(稀釋比例為1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光顯色，采集圖像，采用Gelpro4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參對照(n=3)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞生長的影響

NAC-1基因特異的siRNA不僅顯著抑制卵巢癌HO8910細胞NAC-1基因表達，轉(zhuǎn)染48 h后，NAC-1 mRNA和蛋白表達水平較空白對照組分別下降83%和87%(圖1)，而且明顯抑制HO8910細胞增殖和集落(圖2，3)。

圖1 NAC-1基因特異性siRNA對卵巢癌HO8910細胞中NAC-1基因表達的影響Fig 1 Effects of NAC-1 siRNA on the expressions of of NAC-1 mRNA and protein in ovarian cancer HO8910 cells，n=3)

2.2 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞周期分布的影響

NAC-1基因沉默后G1期細胞比例顯著增高，與空白對照組及陰性siRNA組兩者細胞周期分布相比較有顯著差異(p＜0.05)(圖4，表2)。

2.3 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞Wnt/β-catenin信號途徑信號分子基因的影響

圖4 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞Wnt/β-catenin信號途徑LRP6、β-catenin、cyclin D1和survivin基因表達的影響Fig 4 Effects of NAC-1 siRNA on expression of LRP6，β-catenin，cyclin D1，and survivin genes in ovarian cancer HO8910 cells(n=3)

表2 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞周期分布的影響Table 2 Effect of NAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells，%，n=3)

表2 NAC-1基因沉默對卵巢癌HO8910細胞周期分布的影響Table 2 Effect of NAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells，%，n=3)

*P ＜0.05 compared with the control group．

group G0/G1 S G2/M control 43.54±5.72 24.91±4.48 31.55±4.76 negative siRNA 42.91±5.76 25.43±4.61 31.66±4.73 NAC-1 siRNA 54.93±6.49*13.84±3.15 31.23±4.74

NAC-1基因沉默顯著抑制卵巢癌HO8910細胞Wnt/β-catenin信號途徑活性:NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，β-catenin、cyclin D1和survivin蛋白水平顯著低于空白對照組(p＜0.01)(圖4B);cyclin D1、survivin基因mRNA表達水平則分別較空白對照組下降63%和67%(p＜0.01)(圖4A)。

3 討論

經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)途徑主要成分包括細胞外因子(Wingless，Wnt)、跨膜受體(frizzled，F(xiàn)rz)、輔助受體(LRP-5和LRP-6)、β-catenin等一系列蛋白質(zhì)，靶基因包括C-MYC、cyclin D1和survivin基因。Wnt/β-catenin信號途徑活性主要表現(xiàn)在 p-LRP6和βcatenin蛋白水平的變化，大量游離的β-catenin在胞質(zhì)中聚集并進入胞核內(nèi)和T細胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結(jié)合，并調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin信號途徑在細胞增殖中起重要作用，過度激活時會影響到細胞的增殖、分化，促進腫瘤的發(fā)生。靶基因survivin基因在卵巢癌組織中高表達，對卵巢癌發(fā)生發(fā)展具有重要作用［6－9］。細胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)與特定的CDK(周期素依賴性激酶)結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體，可在G1/S交界處將信號傳導(dǎo)途徑與細胞周期調(diào)控聯(lián)系起來，完成各個時期的轉(zhuǎn)換。其過度表達可縮短G1期，并減少對生長因子的依賴性，促使細胞越過G0/S和(或)G1/S過渡點而持續(xù)分裂增殖，促進腫瘤的生長。本研究則顯示，NAC-1基因沉默不僅抑制卵巢癌HO8910細胞生長、阻滯卵巢癌HO8910細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化，而且Wnt/β-catenin途徑活性下降，即β-catenin蛋白以及下游靶基因cyclin D1和survivin基因表達水平降低。這表明，NAC-1通過增強Wnt/β-catenin途徑活性，參與調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的生長和存活。

NAC-1(nucleus accumbens-1)是一個新的干細胞多能性因子，屬于 BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員［10］，能調(diào)節(jié)其他多能分化因子的表達，如Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和 Sall4 等，參與胚胎干細胞的自我更新和多能性分化，對胚胎干細胞的多能分化是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌化療后復(fù)發(fā)的患者體內(nèi)NAC-1表達水平明顯高于初發(fā)未治者，并證明其與卵巢癌復(fù)發(fā)有關(guān)［11－12］。研究顯示［3］，特異性NAC-1 siRNA可沉默卵巢癌細胞中的目的基因NAC-1、并明顯抑制其生長，且細胞周期被阻滯于G1期。本研究結(jié)果則在這些基礎(chǔ)上分析了信號機制。但NAC-1增強Wnt/β-catenin途徑活性的機制有待進一步研究。

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