郭 穎，曲彥明，2，韓 松，鐘 潔，于春江，李俊發(fā)*

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，其預(yù)后較差，5年生存率不足5%［1］。近年來，隨著腫瘤免疫治療的進(jìn)展，針對多靶點(diǎn)的分子免疫治療逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。既往諸多研究提示，細(xì)胞黏附分子表達(dá)水平的增高與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，是免疫球蛋白家族的成員之一，既往關(guān)于其在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平變化及其作用機(jī)制的研究存在分歧。本研究旨在應(yīng)用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡(Western bolt)方法，觀察不同病理級別人腦膠質(zhì)瘤組織中VCAM-1的分布及表達(dá)變化情況，研究其與膠質(zhì)瘤病理分級之間的關(guān)系，探討VCAM-1在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

連續(xù)收集北京三博腦科醫(yī)院神經(jīng)外科2011年2月至2011年6月間確診并手術(shù)切除的30例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，所有病例臨床資料完整，病理診斷明確。其中男性18例，女性12例，平均年齡(48.1±12.2)歲(最小19，最大68)。病程最短10 d，最長2年，平均為6個月。組織學(xué)分型及病理分級嚴(yán)格按WHO(2010年)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅱ級膠質(zhì)瘤7例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤8例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤15例。Ⅰ級膠質(zhì)瘤因樣本例數(shù)少，未列入本次實(shí)驗(yàn)的研究對象。另取6例同期非腫瘤患者顱腦外傷行內(nèi)減壓而切除的腦組織標(biāo)本作為正常對照，1例血管瘤標(biāo)本作為陽性對照。組織標(biāo)本均液氮速凍，每個標(biāo)本的部分組織提取蛋白用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，部分經(jīng)甲醛溶液固定，制備成石蠟切片后用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。本研究符合相關(guān)倫理委員會規(guī)定，所有標(biāo)本取得均遵循患者及家屬知情同意原則。

兔疫源性VCAM-1多克隆抗體(Santa Cruz公司)，鼠源性β-actin抗體(Proteintech Group公司)，增強(qiáng)型放射免疫沉淀檢測(RIPA)裂解液(Sigma-Aldrich公司，額外加入2%SDS)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(中山金橋生物技術(shù)有限公司);增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(普利萊生物技術(shù)有限公司);二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(Pierce公司);BioMaxMR X線片(Kodak公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色:標(biāo)本取材后，4%甲醛固定液，放入自動脫水機(jī)中脫水，液態(tài)石蠟包埋組織后切片，梯度水化，置入3%H2O2溶液中，室溫15 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶;棄去H2O2溶液，用磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min;用5%羊血清室溫下孵育30 min，封閉非特異性抗原的結(jié)合位點(diǎn);移去血清，加入PBS稀釋的兔源性抗VCAM-1一抗(1∶200)濕盒內(nèi)孵育，4℃過夜;次日，回收一抗，用PBS漂洗3次，每次5 min;加入PBS稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min;棄二抗，PBS漂洗3次，每次5 min;加DAB避光顯色3～5 min，至顯色滿意后加入PBS緩沖液漂洗，終止反應(yīng);蘇木精復(fù)染細(xì)胞系1～2 min;梯度脫水、透明后中性樹脂封片。

結(jié)果判斷:陽性信號呈棕黃、棕褐色，定位于胞膜和(或)胞質(zhì)。隨機(jī)選取10個高倍視野，計(jì)數(shù)每個視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，所得百分?jǐn)?shù)即為VCAM-1陽性率。

1.2.2 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測:蛋白樣品制備、SDS-聚丙烯酰胺電泳(PAGE)和Western blot參照文獻(xiàn)［3－4］。稱取收集的腦組織標(biāo)本0.2 g，剪碎組織，加入PBS漂洗，10 000 r/min離心30 s，棄去含有血液等雜質(zhì)的上清液，加入100μL裂解液，勻漿器研磨至無肉眼可見碎片(冰上操作)，超聲5～6次，10 000 r/min離心1 min，取上清，BCA法測蛋白濃度，定量，配制蛋白電泳樣品。取60μg總蛋白上樣于10%SDS-PAGE，進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)10%脫脂牛奶封閉1 h后，TTBS漂洗3次，每次10 min。用兔源性抗VCAM-1一抗(1∶200)室溫?fù)u床孵育3 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用TTBS稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫?fù)u床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min;洗膜后用ECL發(fā)光，暗房內(nèi)X線膠片曝光、顯影、定影。在同一張PVDF膜上，TTBS漂洗后，牛奶封閉1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用鼠源性抗β-actin一抗 (1∶1 000)室溫?fù)u床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用TTBS稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫?fù)u床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光及暗室曝片方法如前所述。所得結(jié)果用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one進(jìn)行吸光度積分值分析。以血管瘤陽性對照組VCAM-1蛋白表達(dá)水平為標(biāo)準(zhǔn)，以β-actin蛋白表達(dá)量為內(nèi)參，分別統(tǒng)計(jì)分析正常組與腦膠質(zhì)瘤組、Ⅱ級膠質(zhì)瘤組與Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組、Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組之間VCAM-1蛋白表達(dá)水平的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用Bonfferoni檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖采用SigmaPlot 10.0繪圖軟件進(jìn)行繪圖統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 正常腦組織及不同級別膠質(zhì)瘤組織中VCAM-1的表達(dá)和分布

正常腦組織中神經(jīng)細(xì)胞未見陽性染色，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1染色陽性，在不同病理級別膠質(zhì)瘤組織內(nèi)部，出現(xiàn)了不同數(shù)量VCAM-1表達(dá)陽性細(xì)胞，并且隨腫瘤病理級別的增高，VCAM-1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，顯著高于正常腦組織 (p＜0.05);Ⅲ級和Ⅳ級惡性膠質(zhì)瘤與Ⅱ級低級別膠質(zhì)瘤相比，陽性細(xì)胞率亦顯著增高(p＜0.05);而兩種高級別惡性膠質(zhì)瘤之間VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)無顯著差異。Ⅲ級和Ⅳ級惡性膠質(zhì)瘤組織中，VCAM-1陽性細(xì)胞多集中分布于腫瘤微血管周圍(圖1)。

圖1 免疫組化結(jié)果顯示正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)VCAM-1陽性染色細(xì)胞數(shù)及分布情況Fig 1 Immunohistochemistry results showed the changes in protein expression and distribution of VCAM-1 in normal brain and brain glioma tissue

2.2 正常腦組織及不同級別膠質(zhì)瘤組織中VCAM-1表達(dá)水平的變化

正常腦組織中，VCAM-1蛋白表達(dá)水平較低，而在人腦Ⅱ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織內(nèi)其蛋白表達(dá)量均明顯增高(圖2～4)(p＜0.05);隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的提高，VCAM-1蛋白表達(dá)水平亦明顯增高，即Ⅲ級和Ⅳ級腦惡性膠質(zhì)瘤組與Ⅱ級膠質(zhì)瘤相比，VCAM-1蛋白呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(圖3)(p＜0.05)，而VCAM-1蛋白表達(dá)量在腦膠質(zhì)瘤Ⅲ級與Ⅳ級間無顯著性差異。

圖4 不同級別腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)VCAM-1蛋白表達(dá)量的定量分析結(jié)果Fig 4 Quantitative analysis of VCAM-1 protein expression in different grade of cerebral glioma tissue，n=6～15)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，盡管采取手術(shù)、化療和放療等多種治療手段，復(fù)發(fā)率依然較高，預(yù)后較差。細(xì)胞黏附分子是一種跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用。在胚胎發(fā)生、免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［5］。作為一類重要的細(xì)胞黏附分子，VCAM-1(CD106)，分子質(zhì)量約為110 ku，細(xì)胞外含有7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，配體是穩(wěn)定表達(dá)于多數(shù)單核細(xì)胞表面的 α4β1整合素，即VLA-4［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)，VCAM-1主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面;關(guān)于其作用的研究主要集中在免疫炎性反應(yīng)［7］。既往研究報(bào)道，VCAM-1在正常細(xì)胞不表達(dá)或很少表達(dá)，而在肝癌、腎癌、乳腺癌和鼻咽癌等腫瘤組織中異常高表達(dá)。關(guān)于VCAM-1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平研究結(jié)果不一。有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞通過多種途徑刺激血管生成，同時抑制VCAM-1表達(dá)，有利于減少免疫細(xì)胞浸潤，降低局部免疫應(yīng)答，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［8－9］。與之相反，另有研究認(rèn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身和血管細(xì)胞內(nèi)VCAM-1表達(dá)量增加，有利于腫瘤細(xì)胞黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞沿血管遷移和侵襲，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸能力［10］。在對C6腦膠質(zhì)瘤大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，通過光動力學(xué)療法(PDT)聯(lián)合抑制VCAM-1的表達(dá)相對于單獨(dú)應(yīng)用PDT療法可以更大程度抑制瘤體生長，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，有效延長動物生存期［11］。在用星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞所構(gòu)建的大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中，兩種動物瘤體大腦皮質(zhì)及海馬等部位均發(fā)現(xiàn)VCAM-1與Nestin共表達(dá)，并且主要集中分布于腫瘤微血管周圍［12］。腫瘤組織內(nèi)部血管微環(huán)境對于腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要的調(diào)控作用［13］，提示VCAM-1可能與腫瘤干細(xì)胞的作用相關(guān)。

通過本實(shí)驗(yàn)對所收集的臨床腦膠質(zhì)瘤病理組織的研究，已經(jīng)獲得上述確切的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了VCAM-1蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理級別存在一定的相關(guān)性。結(jié)合既往研究推測，VCAM-1可能通過參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫功能及腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)功能等機(jī)制在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，關(guān)于其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探討。

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