基于28S, COI和Cytb基因序列的薜荔和愛玉子傳粉小蜂分子遺傳關系研究

吳文珊,陳友鈴,孫伶俐,毛建萍,楊問新,王愛芳

(福建師范大學生命科學學院，福建省發(fā)育與神經生物學重點實驗室，福州 350117)

基于28S,COI和Cytb基因序列的薜荔和愛玉子傳粉小蜂分子遺傳關系研究

吳文珊,陳友鈴*,孫伶俐,毛建萍,楊問新,王愛芳

(福建師范大學生命科學學院，福建省發(fā)育與神經生物學重點實驗室，福州 350117)

薜荔和愛玉子均屬于桑科榕屬植物，二者為同一物種的原變種與變種的關系，早期研究認為這兩種榕樹與同一種傳粉榕小蜂(Wiebesiapumilae(Hill))建立了穩(wěn)定的互利共生關系，但近期在形態(tài)學、生態(tài)學、傳粉生物學等方面對二者的研究結果表明，薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂之間可能發(fā)生了遺傳分化。實驗用核糖體28SrDNAD1-D3區(qū)、線粒體Cytb及COI基因部分序列，對采自福建3個不同樣地的薜荔傳粉小蜂和3個不同品系的栽培愛玉子的傳粉小蜂進行分析，結果表明：(1)薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂的核糖體28S序列的堿基組成中A，T，G，C 4種含量較平均，C+G的平均含量(56%)稍高于A+T的含量(44%)。線粒體Cytb序列中A+T的含量(76.1%)明顯高于C+G的含量(23.9%)，COI序列中A+T的含量(71.9%)也明顯高于G+C的含量(28.1%)，這是膜翅目昆蟲線粒體基因的普遍特征。在薜荔和愛玉子傳粉小蜂的線粒體Cytb及COI基因中，密碼子第三位點A+T的含量最高。(2)比較薜荔和愛玉子傳粉小蜂的3種分子標記的變異范圍顯示，28S進化速度較Cytb及COI序列慢，比較保守，更適合科、亞科等較高分類單元的研究。薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間的親緣關系較近，采用Cytb與COI序列進行分析更為精確。(3)用Cytb及COI序列對薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間的遺傳距離進行分析顯示，薜荔傳粉榕小蜂個體間Cytb序列平均遺傳距離為0.0054，愛玉子傳粉小蜂個體間的Cytb遺傳距離為0.0164；薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂群體之間的Cytb序列平均遺傳距離為0.1385；COI序列的薜荔傳粉榕小蜂個體間遺傳距離為0.0048，愛玉子傳粉小蜂各樣本間平均遺傳距離為0.0102；薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂群體間COI序列平均遺傳距離為0.1896，兩群體間的遺傳距離(差異大于10%以上)明顯大于群體內各樣本之間的遺傳距離，表明薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間已經發(fā)生了很大的遺傳分化，其變異水平達到了種間分化水平，即薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂為兩個不同的種。

薜荔； 愛玉子； 榕小蜂； COI；Cytb；28S

薜荔(Ficuspumilavar.pumila)隸屬桑科榕屬，為攀援或匍匐灌木，主要分布于福建、江西、浙江、安徽、江蘇、臺灣、湖南、廣東、廣西、貴州、云南東南部、四川及陜西等地，被廣泛用于園林的綠化[1- 2]，愛玉子(Ficuspumilavar.awkeotsang)為薜荔的變種，是我國特有的植物，原產自臺灣，在福建、浙江等地少量的野生分布，目前在臺灣和大陸長江以南有廣泛栽培[1,3]。

薜荔和愛玉子在植株性狀、莖葉形態(tài)、花與花序的形態(tài)結構等方面均十分相似，二者究竟是原變種與變種的關系，擬或為不同的兩個種，長期以來爭論不休。李和惠用trnT-trnL序列和核內NIA-i3和ITS2序列對薜荔和愛玉子植株進行研究發(fā)現，核內NIA-i3和ITS2序列兩者之間不存在差異，trnT-trnL序列上存在微小差異，認為兩者為同一個種[4]。而林贊標的研究表明，愛玉子瘦果中的果膠甲酯酶的活性(95.8活性單位)比薜荔(4.8活性單位)高很多，且愛玉子果膠甲酯酶有兩個亞型，在薜荔果膠甲酯酶只有一個亞型[5]，暗示薜荔和愛玉子可能是親緣關系很近的兩個不同的種。

長期以來，人們一直認為薜荔與愛玉子的傳粉小蜂為同一種傳粉榕小蜂(Wiebesiapumilae(Hill))[6- 7]。1991年何坤耀從臺灣各地采集的愛玉子及薜荔的傳粉小蜂進行研究，也認為臺灣地區(qū)的薜荔與愛玉子共享一種傳粉小蜂，并且與香港的模式標本無形態(tài)差異，同時，還觀察到在臺灣存在薜荔的雄株的地方，栽培愛玉子均能成功繁殖[8]。但近年來，越來越多的證據表明愛玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂之間可能已經發(fā)生了變異，例如，Chen 等發(fā)現福建愛玉子栽培園內即使種植薜荔雄株(有傳粉小蜂)，卻不能使愛玉子結實，同時，薜荔、愛玉子繁殖生物學的調查表明，二者之間已經存在生殖隔離[9]。江少華在臺灣高雄地區(qū)開展的薜荔和愛玉子之間的人工輔助雜交實驗結果表明：1)薜荔的傳粉小蜂可以進入愛玉子的雌花期花序內授粉并能結實，但無法進入愛玉子雄花序；2)愛玉子傳粉小蜂可以進入薜荔的雌花期花序內授粉并能結實，也可以進入雄花序產卵，但幼蟲的死亡率高，小蜂發(fā)育與花序發(fā)育異步，導致羽化的小蜂無法出飛[10]。隨著分子生物學的發(fā)展，有關榕小蜂的分子生物學研究越來越多，李和惠對兩個來自臺灣不同地區(qū)的薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂進行COI序列研究發(fā)現，兩者的遺傳距離為11.7%，認為兩種小蜂已經發(fā)生了很大的變異[4]。同時，陳艷對我國東南沿海及島嶼不同地理分布的薜荔榕小蜂進行研究發(fā)現，薜荔榕小蜂存在Sp.A、Sp.B、Sp.C3個隱存種[11]。以上證據表明，親緣關系密切的薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂之間可能發(fā)生了遺傳分化。

由于薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間的形態(tài)差異極其細微，僅依賴傳統的形態(tài)標記分類方法，難以將它們區(qū)別開來。薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂究竟是同種？還是兩個不同的種？或是互為隱種關系？這一直是懸而未決的問題。分子標記技術的快速發(fā)展，給這一難題的解決帶來希望。本文用核糖體28SrDNAD1—D3，以及線粒體COI和 Cytb三種分子標記對分類地位模糊的薜荔和愛玉子傳粉小蜂進行鑒定，明確薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間的分子遺傳關系，以期在愛玉子的經濟栽培中起到指導性作用。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集及保存

從2010年3月至2012年12月間于福建省福州市、莆田市等地采集實驗小蜂，樣本及采集地點(表1)。將采集來的榕小蜂存放入含有無水乙醇保存液的1.5 mL的離心管中，使小蜂迅速死亡，置于-20 ℃保存。

表1 實驗材料及采集地及其登陸號

愛玉子:F.pumilavar.awkeotsang；薜荔：F.pumilavar.pumila；黃葛樹:F.virens；高榕：F.altissima; “-”表示無此樣本

1.2 基因組DNA的提取，PCR及測序

取95%的酒精-20 ℃下儲存的榕小蜂樣品，用酚氯仿抽提法進行基因組DNA提取。用提取的基因組DNA進行目的片段PCR擴增。

28S序列上游引物 28S-F：5′-ACCCGCTGAATTTAAGCATAT-3′

28S序列下游引物 28S-R：5′-TAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3′

28S序列擴增條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性60 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸70 s，34個循環(huán)后72℃延伸7 min結束，4 ℃保溫。

COI序列上游引物 COI-F：5′CAACATTTATTTTGATTTTTTGG3′

COI序列下游引物 COI-R：5′TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA3′

COI序列PCR擴增條件為：94℃預變性3 min，94 ℃變性60 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，34個循環(huán)后72 ℃延伸7 min結束，4 ℃保溫。

Cytb序列上游引物 Cytb-F：5′TATGTACTACCATGAG GACAAATATC3′

Cytb序列下游引物 Cytb-R：5′ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT3′

Cytb序列擴增條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán)后72 ℃延伸5 min結束，4 ℃保溫。

對PCR擴增的產物直接進行測序，所有PCR產物均送至生工生物公司進行測序。將測序所得序列上傳GenBank上。

1.3 數據處理

得到測序序列后，在NCBI上用BLAST進行相似性檢索，確定所得的序列確實為目的片段。將這些片段用CLUSTAL X 1.83進行序列比對， BioEdit 3.3校正比對結果，截取相同長度的序列進行分析，運用MEGA 4.0軟件計算不同序列的堿基組成及堿基替換，用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹并進行系統進化分析，計算K2P遺傳距離。

2 結果

2.1 榕小蜂核糖體28S序列分析

2.1.1 榕小蜂28S序列組成分析

對榕小蜂28S序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進行序列比對，截取對準的941 pb序列進行分析，用Mega4.0軟件中的Data explore軟件進行各小蜂的堿基組成分析。在28S序列中，不變位點702個，變異位點233個，簡約信息位點91個，自裔位點140個，變異性為24.8%。各樣品的堿基組成分析見表2，由表2可知，所有的小蜂樣本堿基組成都比較平均，C+G的含量在55.7%—58.4%，C+G的含量略大于A+T的含量。

2.1.2 榕小蜂核糖體28S序列的遺傳距離分析

用Mega4.0軟件中的K2P法計算遺傳距離(表3)。所有樣品間的遺傳距離在0.0000—0.1503之間，愛玉子傳粉小蜂樣品間的遺傳距離為0.0000；薜荔傳粉小蜂樣品間遺傳距離為0.0017；兩群體間的平均遺傳距離為0.0043。

表2 榕小蜂28S序列的堿基組成

表3 基于Kimura雙參數模型榕小蜂28S序列的遺傳距離

2.1.3 榕小蜂核糖體28S序列系統發(fā)育樹的構建

在NCBI網站上對實驗中的28S序列進行同源性檢索，下載4種前人研究過的榕小蜂28S序列(表4)進行分析。

表4 GenBank上下載的榕小蜂28S序列

圖1 鄰接法構建的榕小蜂28S序列系統發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on 28S sequence of fig wasps

用Mega4.0軟件對實驗所得與GenBank中下載的榕小蜂28S序列用NJ(Neighbor-joining)法，同時用重復抽樣1000次檢驗分子系統樹各分支的置信值，建立系統發(fā)育樹見圖1。圖中顯示，相同屬的小蜂匯聚到一起，顯示出較近的親緣關系，愛玉子傳粉小蜂3個樣本和薜荔傳粉小蜂兩個樣本各自先匯聚成一支，再匯聚到一起，表明薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂群體之間已經產生了一定的變異。圖中顯示每個屬的小蜂都能夠明顯的區(qū)分開來，這說明28S序列可以做為小蜂分子分類的鑒定依據。

2.2 榕小蜂線粒體Cytb及COI序列分析

2.2.1 Cytb與COI序列堿基組成及變異分析

(1) Cytb序列組成及變異分析

對榕小蜂Cytb序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進行序列比對，截取對準的376pb序列進行分析，用Mega 4.0軟件中的Data explore軟件進行各小蜂的堿基組成分析。在Cytb序列中，不變位點243個，變異位點132個，簡約信息位點73個，自裔位點59個，變異性為35.1%。A，T，G，C四種堿基的平均含量為32.9%，43.2%，9.7%，14.1%，A+T的平均含量為76.1%，顯著高于G+C的含量，符合膜翅目昆蟲線粒體基因序列的共同特點。

Cytb密碼子不同位點的核苷酸頻率及堿基替換統計見表5，表中可知，Cytb序列密碼子的各個位點上A+T含量均偏高，第三位點A+T的含量高達92.3%，A+T偏向尤為明顯，其中T的使用最為頻繁為54.3%。說明Cytb基因在密碼子使用上具有偏向性。實驗樣本中Cytb序列上核苷酸顛換數大于轉換數。密碼子第三位點的轉換(si)和顛換(sv)發(fā)生的頻率明顯高于第一、二位點。

表5 Cytb密碼子不同位點的堿基頻率及堿基替換

(2) COI序列組成及變異分析

對榕小蜂COI序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進行序列比對，截取對準的931pb序列進行分析，用Mega4.0軟件中的Data explore軟件進行各小蜂的堿基組成分析，在COI序列中，有不變位點641個，變異位點285個，簡約信息位點99個，自裔位點186個，總體變異性為14.2%，較Cytb序列總體變異性低。A，T，G，C四種堿基的平均含量為32.5%，39.4%，16.8%，11.2%，A+T的平均含量為71.9%，顯著高于G+C的含量，與Cytb序列一致符合膜翅目昆蟲線粒體基因序列的共同特點。

COI密碼子不同位點的核苷酸頻率及堿基替換統計見表6，表中可知，與Cytb序列相似COI序列密碼子的各個位點上A+T含量均偏高，第三位點A+T的含量為86.2%，A+T偏向最為明顯。說明COI基因在密碼子使用上也具有偏向性。

表6 COI密碼子不同位點的堿基頻率及堿基替換

2.2.2 Cytb與COI序列遺傳距離分析

(1) Cytb序列的遺傳距離分析

運用Mega 4.0軟件，基于K2p模型計算兩兩序列間的遺傳距離，對各樣品間遺傳距離的統計見表7。試驗小蜂群體核苷酸遺傳距離在0—0.3322之間，愛玉子傳粉小蜂個體間的遺傳距離為0.0164，薜荔傳粉榕小蜂個體間遺傳距離為0—0.0081，平均遺傳距離為0.0054。愛玉子與薜荔傳粉小蜂之間的遺傳距離為0.1369—0.1416，平均遺傳距離為0.1385。

表7 基于Kimura雙參數模型榕小蜂Cytb序列的遺傳距離

(2) COI序列的遺傳距離分析

運用Mega 4.0軟件，基于K2P模型計算兩兩序列間的遺傳距離，對各樣品間遺傳距離的統計見表8。試驗小蜂群體COI序列核苷酸遺傳距離0.0038—0.8707在之間，愛玉子傳粉小蜂個體間的遺傳距離在0.0038—0.0153，平均遺傳距離為0.0102。薜荔傳粉榕小蜂各樣本間遺傳距離為0.0048。愛玉子與薜荔傳粉小蜂之間的遺傳距離為0.1854—0.1938，平均遺傳距離為0.1896。

表8 基于Kimura雙參數模型榕小蜂COI序列的遺傳距離

2.2.3 Cytb及COI序列系統發(fā)育樹的建立

實驗所得序列在NCBI網站上進行Blast相似性檢索，下載得到8種有榕小蜂的Cytb序列5種COI序列(見表9)與實驗所得序列一起建立系統發(fā)育樹(圖2，圖3)，來分析小蜂之間的系統發(fā)育情況。

表9 GenBank上下載的榕小蜂Cytb與COI序列

用Mega4.0軟件對實驗所得與GenBank中下載的榕小蜂Cytb與COI序列用NJ(Neighbor-joining)法，同時用重復抽樣1000次檢驗分子系統樹各分支的置信值，建立系統發(fā)育樹見圖2、圖3。圖中顯示，樣本中屬于同一個屬的不同種的樣本匯聚到一起，顯示出較近的親緣關系?；趦煞N序列建立的系統發(fā)育樹在薜荔與愛玉子小蜂上顯示出相似的拓撲結構，愛玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂個體先分別匯聚成一支然后兩群體再匯聚到一起，這顯示出兩群體之間親緣關系相對較近，同時產生了一定的變異。每個屬的小蜂都能夠明顯的區(qū)分開來，這說明Cytb與COI基因為榕小蜂鑒別的良好的分子標記。

3 討論

3.1 3種分子標記特征分析

很多學者認為，如果用分子的手段進行種類鑒定時，不能只用某一個基因，因為一個基因所含有的基因數量有限，只用一個基因來進行種類鑒定存在很大的風險。與用傳統的形態(tài)學方法來進行鑒定物種一樣，很少只用某一個特征來鑒定物種，因為這樣往往使鑒定的結果不夠準確[12]。本研究用核糖體28S，線粒體Cytb及COI三個片段共同進行研究，這樣就避免了一個基因片段含有的信息量有限而給研究帶來的誤差。對3種遺傳標記序列分析結果表明，28S序列中4種堿基的含量較為平均，G+C堿基的平均含量為56%，比A+T的含量稍高，符合Campbell小蜂總科28SD2序列對小蜂總科及各科間的系統發(fā)育關系進行研究時得出的28SD2序列G+C堿基的含量偏高的結論[13]。而Cytb與COI基因片段的堿基組成都一致的顯示出A+T含量明顯較高的特點，有研究顯示榕小蜂線粒體基因有A+T含量偏高的特點[11, 14]。并且Cytb及COI基因在密碼子的不同位點上顯示出了對堿基的不同偏好，特別是第三位點，Cytb基因密碼子的第三位點上A+T的含量高達92.7%，COI基因該位點A+T的平均含量為86.2%。這種偏好性產生的原因可能是因為密碼子第三位點產生的突變多為同義突變，發(fā)生該突變不會影響基因編碼的蛋白質序列，對榕小蜂的影響較小，受到自然選擇的壓力較小，突變容易被保留下來[15- 16]。

圖2 鄰接法構建的榕小蜂Cytb序列系統發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on Cytb sequence of fig wasps

圖3 鄰接法構建的榕小蜂COI序列系統發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on COI sequence of fig wasps

3.2 3種分子標記適用性分析

選擇合適的分子標記，是用DNA序列進行準確分析的前提，不同的DNA序列在生物體中行使不同的功能，所承受的環(huán)境的選擇壓力不同，因而在序列的進化速度上存在差異。對生物不同分類階元進行鑒定時，對所選擇的分子標記的變異速度有不同的要求。在對亞種、種、屬等較低的分類階元進行研究時，要求所選擇的分析標記要有較快的變異速度，這樣才能確保在親緣關系較近的不同個體之間存在足夠的變異能夠將它們區(qū)別開來。但是當研究樣本之間是科、目等較高的分類群體時，由于較高的分類階元之間產生分化的時間比較久遠，在不同的群體之間不僅在形態(tài)上往往存在較大的差異外，在分子水平上也已經形成了穩(wěn)定而顯著的差異，因此在分析時要選擇進化速度較慢，相對保守的分子標記進行分析。對實驗中3種序列進行K2P遺傳距離分析顯示，28S序列小蜂群體的遺傳距離為0—0.1503，Cytb序列小蜂遺傳距離為0—0.3322，COI序列分析小蜂遺傳距離為0.0038—0.8707，這說明Cytb與COI基因進化速度較快，而28S序列相對比較保守。有研究認為28S片段非常保守，更適合高級階元(屬、亞科)系統發(fā)育的研究[13, 17]。薜荔傳粉榕小蜂與愛玉子傳粉榕小蜂之間的親緣關系很近，甚至被認為是同一個種，所以用進化速度相對較快的Cytb及COI序列對兩者進行系統發(fā)育分析較為妥當。

3.3 薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂分子遺傳關系確定

對一些動物的 Cytb基因序列分析表明，種內個體間的差異一般在0%—4.06%，當個體差異超過6%時就說明個體間已有亞種或種的分化[18- 19]。Xiao等研究顯示榕小蜂Cytb基因序列種間差異一般在11%—22%之間[20]，本實驗中愛玉子傳粉小蜂個體間的Cytb遺傳距離為0.0164，薜荔傳粉榕小蜂個體間Cytb序列平均遺傳距離為0.0054；愛玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂群體之間的Cytb序列遺傳距離為0.1385，兩群體間的遺傳距離明顯大于群體內部各樣本之間的遺傳距離，表明薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間的變異已達到了種間分化的水平。

Herbert利用COI序列對鱗翅目分屬5個科的200個近緣種昆蟲進行K2P遺傳距離的研究顯示，其種內平均差異僅為0.25%，屬內種間差異在5.8%—9.1%之間，種間平均差異為6.8%[21]。目前關于榕小蜂種間、種內差異的標準還比較少，姜自鋒(2005)利用COI基因開展榕小蜂分子系統學研究時，將遺傳距離3%的差異水平作為區(qū)分種間和種內關系的界限[22]。李艷偉對189種榕小蜂進行COI序列分析顯示，約123個種(65%)的種內差異小于2%，32個種(17%)的種內差異在2%—5%之間，即共有155個種(82%)的種內差異小于5%；約132個種(70%)的種間差異在10%—15%之間，有32個種(17%)的種間差異大于20%[12]。Zhou等在對Philotrypesis小蜂進行分子鑒定時，顯示榕小蜂的COI序列差異達到5.8%—6.0%時可以鑒定成不同的種[23]。本實驗中薜荔傳粉榕小蜂個體間COI序列遺傳距離為0.0048，愛玉子傳粉小蜂各樣本間COI序列平均遺傳距離為0.0102；愛玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂群體間COI序列平均遺傳距離為0.1896，兩榕小蜂群體間的遺傳距離明顯大于群體內部各樣本之間的遺傳距離，實驗中所研究的愛玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂之間已經發(fā)生了很大的分化，其變異水平已經達到了種的分異水平。

綜上所述，基于28S，Cytb及COI序列所得的結果顯示，福建地區(qū)的薜荔傳粉小蜂和愛玉子傳粉小蜂各自群體內部的遺傳距離都很小，沒有隱存種的分化，Cytb與COI序列分析結果一致表明二者群體之間的遺傳距離達到了種間分異的水平，加之Chen等人研究顯示福建地區(qū)的薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂之間已存在生殖隔離[9]，因此薜荔傳粉小蜂與愛玉子傳粉小蜂可以被認為是兩個不同的種。

致謝：感謝福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心陳騏教授對寫作的幫助。

[1] Zhang X S, Wu Z Y, Cao Z Y. Flora of China. Vol. 23, No. l. Beijing: Science Press, 1998: 205- 206.

[2] Wu W S, Chen Y L. Comparison of reproduction ecology of differentFicusawkeotsangstrains. Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(10): 4692- 4702.

[3] Chen Y L, Wu W S. Volatile compounds from the syconia ofFicusawkeotsangMakino and their attractiveness to pollinator wasps. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(8): 2212- 2219.

[4] Lee H H. Genetic Differentiation betweenFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangand Their Pollinators [D]. Taibei: Department of Entomology College of Bioressources and Agriculture National Taiwan University, 2009.

[5] Lin T-P, Liu C-C, Yang C-Y, Huang R-S, Lee Y-S, Chang S-Y. Morphological and biochemical comparison of syconium ofFicusawkeotsangandFicuspumila. Research Report Quarterly of Taiwan Forestry Research Institute, 1990, 5(1): 37- 43.

[6] Chen Y, Li H Q, Ma W L. The reproductive character ofFicuspumilavar.pumila,F.pumilavar.awkeotsangand their pollinators. Acta Phytoecologica Sinica, 2002, 26(1): 58- 63.

[7] Chen Y, Li H Q, Ma W L. Pollination ecology of cultivatedFicuspumilavar.awkeotsang. Chinese Journal of Applied Ecology, 2006, 17(12): 2403- 2407.

[8] He K Y. The Pollinators ofFicuspumilavar.Awkeotsang// Lin T P, ed.Ficuspumilavar.awkeotsangMonograph. Taibei: Taiwan Forestry Research Institute, 1991: 83- 96.

[9] Chen Y, Liu H Q, Ruan S J, Ma W L. Pollination of a cultivated fig,Ficuspumilavar.awkeotsang, in South China. Symbiosis, 2008, 45(1/3): 33- 36.

[10] Jiang S H. Morphological Differences between Pollinating Fig Wasps ofFicuspumilaL. var.pumilaandFicuspumilavar.Awkeotsang(Makino) Corner and Their Asymmetric Host Specificity [D]. Taibei: Department of Entomology College of Bioressources and Agriculture National Taiwan University, 2011.

[11] Chen Y. The Pollinating Fig Wasps ofFicuspumila[D]. Shanghai: East China Normal University, 2009.

[12] Li Y W. DNA Barcoding in Chinese Fig Wasps [D]. Shandong: College of Plant Protection Shandong Agricultural University, 2009.

[13] Campbell B C, Steffen-Campbell J D, Werren J H. Phylogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer (ITS2) and 28S rDNA sequences. Insect Molecular Biology, 1994, 2(4): 225- 237.

[14] Lopez-Vaamonde C, Rasplus J Y, Weiblen G D, Cook J M. Molecular phylogenies of fig wasps: partial cocladogenesis of pollinators and parasites. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2001, 21(1): 55- 71.

[15] Gao J B, Zhang X W, Zhou G N, Liu J X. Genetic structure ofPinecaterpillars(Dendrolimus) populations based on the analysis of Cyt b gene sequences. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(6): 1727- 1734.

[16] Zhou J L, Zhang Y P, Huang M H, Chen Y J, Chen X Q, Yao G D. Phylogenetic relationships among Crotalinae based on mitochondrial cytochrome B gene sequence variations. Acta Zoologica Sinica, 2001, 47(4): 361- 366.

[17] Dowton M, Austin A D. Simultaneous analysis of 16S, 28S, COI and morphology in the Hymenoptera: Apocrita-evolutionary transitions among parasitic wasps. Biological Journal of the Linnean Society, 2001, 74(1): 87- 111.

[18] Yang X G, Wang Y Q, Zhou K Y, Liu Z Q. Phylogenetic relationships of Chinese brown frogs (Rana) based on sequence of mitochondrial cytochrome b gene. Zoological Research, 2001, 22(5): 345- 350.

[19] Yang X G, Wang Y Q, Zhou K Y, Liu Z Q. Authentication of oviductus ranae and its original animals using molecular marker. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25(8): 1035- 1039.

[20] Xiao J H, Wang N X, Li Y W, Murphy R W, Wan D G, Niu L M, Hu H Y, Fu Y G, Huang D W. Molecular approaches to identify cryptic species and polymorphic species within a complex community of fig wasps. PLoS One, 2010, 5(11): e15067.

[21] Hebert P D, Penton E H, Burns J M, Janzen D H, Hallwachs W. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterflyAstraptesfulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(41): 14812- 14817.

[22] Jiang Z F. Molecular Systematics of Fig Wasps [D]. Beijing: Chinese Academy of Sciences, 2005.

[23] Zhou M J, Xiao J H, Bian S N, Li Y W, Niu L M, Hu H Y, Wu W S, Murphy R W, Huang D W. Molecular approaches identify known species, reveal cryptic species and verify host specificity of ChinesePhilotrypesis(Hymenoptera: Pteromalidae). Molecular Ecology Resources, 2012, 12(4): 598- 606.

參考文獻:

[1] 張秀實, 吳征鎰, 曹子余. 中國植物志 (第二十三卷, 第一分冊). 北京: 科學出版社, 1998: 205- 206.

[2] 吳文珊, 陳友鈴. 愛玉子 (Ficusawkeotsang) 不同品系的繁殖生態(tài)學比較. 生態(tài)學報, 2008, 28(10): 4692- 4702.

[3] 陳友鈴, 吳文珊. 愛玉子花序揮發(fā)物成分以及對其傳粉小蜂的吸引作用. 生態(tài)學報, 2010, 30(8): 2212- 2219.

[4] 李和惠. 薜荔和愛玉子及其授粉小蜂之遺傳分化 [D]. 臺北: 臺灣大學昆蟲學研究所, 2009.

[5] 林贊標, 劉哲政, 楊居源, 黃瑞祥, 李永生, 張森永. 愛玉與薜荔隱花果形態(tài)與其生化特性比較. 林業(yè)試驗所研究報告季刊, 1990, 5(1): 37- 43.

[6] 陳勇, 李宏慶, 馬煒梁. 薜荔和愛玉及其傳粉昆蟲繁殖特性. 植物生態(tài)學報, 2002, 26(1): 58- 63.

[7] 陳勇, 李宏慶, 馬煒梁. 栽培愛玉的傳粉生態(tài). 應用生態(tài)學報, 2006, 17(12): 2403- 2407.

[8] 何坤耀. 愛玉子授粉小蜂 // 林贊標. 愛玉子專論. 臺北: 臺灣林業(yè)實驗所, 1991: 83- 96.

[10] 江少華. 薜荔及愛玉子授粉榕小蜂之形態(tài)差異及其寄主專一性的不對稱性 [D]. 臺北: 臺灣大學昆蟲學研究所, 2011.

[11] 陳艷. 薜荔之傳粉小蜂 [D]. 上海: 華東師范大學, 2009.

[12] 李艷偉. DNA條形碼在中國榕小蜂中的應用研究 [D]. 山東: 山東農業(yè)大學農業(yè)昆蟲與害蟲防治專業(yè), 2009.

[15] 高寶嘉, 張學衛(wèi), 周國娜, 劉軍俠. 基于Cyt b基因序列分析的松毛蟲種群遺傳結構研究. 生態(tài)學報, 2011, 31(6): 1727- 1734.

[16] 周繼亮, 張亞平, 黃美華, 陳永久, 陳小青, 姚耿東. 蝮亞科蛇線粒體細胞色素b基因序列分析及其系統發(fā)育. 動物學報, 2001, 47(4): 361- 366.

[18] 楊學干, 王義權, 周開亞, 劉中權. 從細胞色素b基因序列探討我國林蛙屬動物的系統發(fā)生關系. 動物學研究, 2001, 22(5): 345- 350.

[22] 姜自鋒. 榕小蜂分子系統學研究 [D]. 北京: 中國科學院研究生院, 2005.

ThemoleculargeneticrelationshipbetweenthepollinatorsofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsang

WU Wenshan, CHEN Youling*, SUN Lingli, MAO Jianping, YANG Wenxin, WANG Aifang

ProvincialKeyLaboratoryforDevelopmentalBiologyandNeurosciences，CollegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China

Ficuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangare two varieties of the same species (Moraceae); one is the original variant while the other is a later variant and, they have long been considered to interact with the same species of pollinator. However, the recent studies in morphology, ecology and pollination biology suggest that a differentiation between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangwasps may have occurred during the evolution. In the present studies, we used three molecular markers including 28SrDNA D1—D3, the mitochondrial Cytb and COI genes to investigate the genetic relationship of these two pollinators. The pollinator samples were collected fromFicuspumilavar.pumilaat three different locations as well as three cultivars ofFicuspumilavar.awkeotsang. The data are summarized as follows: (1) The distribution of the four bases including A, T, G, C in the 28SrDNA sequence from the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangis relatively akin. The average content of C + G (56%) is slightly higher than the average content of A+T (44%). The average content of A+T in the mitochondrial Cytb sequence is 76.1%, significantly higher than the average content of C+G (23.9%). The COI sequence analysis shows a similar result, with the A+T content (71.9%), higher than the G+C content (28.1%). This base composition pattern is consistent cross along hymenopteran mitochondrial sequences. Furthermore, in the Cytb and COI sequences, it appears to have the highest content of A/T base at the third position of a codon. (2) The 28SrDNA sequence evolution appears to be slower than the Cytb and COI gene sequences, is relatively conservative, and maybe more suitable for senior-order (family or subfamily) phylogenetic studies. In contrast, the Cytb and COI molecular markers may be more suitable for the genetic relationship analyses between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangdue to their close ties. (3) The results derived from genetic distance analyses show that the average distance of the Cytb sequence of each sample withinFicuspumilaL.pumilapollinator or withinFicuspumilavar.awkeotsangpollinator is 0.0054 or 0.0164. The average genetic distance of the Cytb sequence between the two pollinator groups is 0.1385. The average genetic distance of the COI sequence of each sample withinFicuspumilavar.pumilaorFicuspumilavar.awkeotsangis 0.0048 or 0.0102, while the average genetic distance between the two wasp populations is 0.1896. Since the genetic distance between the two wasp groups are significantly greater than the genetic distance within the respective group, these data suggest that the two groups of fig wasps have differentiated during the evolution and reached to the level of species identification, namely the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangare the two different wasp species.

Ficuspumilavar.pumila;Ficuspumilavar.awkeotsang; fig wasps; COI; Cytb; 28S

國家自然科學基金資助項目(31270440)；福建省科技廳重點資助項目(2011N0014)；福建省高等學校學科帶頭人培養(yǎng)計劃資助項目；福建師范大學生命科學學院生物學拔尖生培養(yǎng)計劃資助項目

2013- 06- 09;

2013- 07- 25

*通訊作者Corresponding author.E-mail: chenyouling2000@126.com

10.5846/stxb201306091500

吳文珊,陳友鈴,孫伶俐,毛建萍,楊問新,王愛芳.基于28S, COI和Cytb基因序列的薜荔和愛玉子傳粉小蜂分子遺傳關系研究.生態(tài)學報,2013,33(19):6049- 6057.

Wu W S, Chen Y L, Sun L L, Mao J P, Yang W X, Wang A F.The molecular genetic relationship between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsang.Acta Ecologica Sinica,2013,33(19):6049- 6057.