響應曲面法優(yōu)化歐李種殼堿性多糖的提取

鄔曉勇，劉云山，顧若璇，劉晨玲，茍小軍

(成都大學 藥食同源植物資源開發(fā)重點實驗室，成都 四川610106)

歐李(Prunus humilisBunge．)為薔薇科櫻桃屬多年生落葉矮生灌木，是我國特有的古老野生樹種，株高0.5～1．5 m，是目前世界上最矮小的木本果樹．主要分布于黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東和山西等省區(qū)，在向陽山坡或沙丘邊緣生長較多，資源相當豐富［1］． 歐李無刺、果大、有柄、高產(chǎn)，而且保鮮期長，可以鮮食，可用于加工果汁［2］、釀酒［3］．歐李果實營養(yǎng)價值高，尤其是鈣和鐵的含量比一般水果都高，且歐李所含的鈣為天然活性鈣，易被吸收，適宜老人和兒童補鈣［4］，便誕生了其商品名“鈣果”．

堿性多糖具有增強免疫力，防衰老等藥理作用［5］．堿溶性多糖類抗腫瘤作用的一大優(yōu)點就是毒副作用小，且與化療藥物有協(xié)同效應并能抵抗化療藥物對骨髓的抑制等毒副作用［6］． 但目前仍未有對歐李多糖研究的相關(guān)文獻，本實驗以歐李種殼為材料，對于其中的堿溶性多糖進行提取，利用響應曲面法對其提取條件進行優(yōu)化，旨在為歐李資源利用提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 試驗材料

從成熟的歐李果實中取種殼，干燥、粉碎制得粉末．

1．2 試驗方法

濃硫酸、濃鹽酸、葡萄糖、苯酚、NaOH(均為分析純)．

分光光度計、精密天平、托盤天平、恒溫水浴鍋、pH 計、離心機、抽濾機．

1．3 方實驗法

1．3．1 葡萄糖標準曲線制作 硫酸苯酚法［7］測定葡萄糖糖含量:準確稱取1．00 g 葡萄糖加蒸餾水溶解，于250 mL 容量瓶定容，制得0．4 mg/mL 的葡萄糖溶液．將制備好的0．4 mg/mL 的葡萄糖溶液用蒸餾水稀釋成0.2、0．1、0．05、0．025、0．012 5、0．006 25 mg/mL 濃度的溶液．將制備好的各種濃度的葡萄糖溶液用硫酸苯酚溶液于沸水浴顯色30 min，用分光光度計490 nm 比色［8］．以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，并建立標準曲線方程．

1．3．2 歐李種殼堿溶性多糖提取的單因素實驗 多糖提取單因素實驗操作流程:準確稱取歐李種殼粉末1.00 g，選定加熱時間、加熱溫度、液料比、NaOH 濃度進行提取，抽濾;用濃鹽酸中和到pH7．00 左右，定容為100 mL，然后稀釋50 倍后硫酸苯酚法顯色，在490 nm 分光光度計下比色，選定最佳單因素．

1．3．3 響應曲面法設(shè)計 每次試驗取歐李種殼粉末1．00 g，選定加熱溫度(A)、加熱時間(B)、NaOH 濃度(C)、液料比(D)作為考察的4 個因素，各設(shè)3 個水平(見表1)，以多糖的含量為考察指標，選用響應曲面法進行試驗．

表1 歐李種殼堿溶性提取多糖的因素水平Tab．1 Factor levels of alkali－soluble polysaccharide extraction from nuclear shell of Cerasus humilis．

利用Design Expert 軟件對四個因素進行響應曲面設(shè)計(見表2)．按照表2 進行實驗，確定最佳的堿性多糖提取條件．

表2 歐李種殼堿性多糖提取的響應曲面設(shè)計表Tab．2 Response surface design table of alkali－soluble polysaccharide extraction

2 結(jié)果與分析

2．1 葡萄糖標準曲線

由1．3．1 試驗方法，以吸光度和葡萄糖濃度建立標準曲線，如圖1 所示，并建立標準曲線方程:y=4．055 9x+0．022 2，線性相關(guān)系:R2=0．995 1．

2．2 單因素實驗

2．2．1 NaOH 濃度對堿溶性多糖提取的影響 在實驗條件為80℃、液料比(mL/g)20 ∶1、加熱時間4 h 的條件下，NaOH 濃度分別為0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3.5、4．0 mol/mL 進行實驗，考察NaOH 濃度對堿溶性多糖提取的影響，試驗結(jié)果見圖2．

圖1 葡萄糖標準曲線圖Fig．1 Standard curve ofglucose

圖2 NaOH 濃度對多糖提取的影響Fig．2 The influence of NaOH concentration on polysaccharide extraction

由圖2 可知，NaOH 濃度在3．5 mol/L 之前，歐李種殼堿溶性多糖的提取百分含量隨著NaOH 濃度的增加而增加，大于3．5 mol/L 之后，多糖的百分含量反而隨著濃度的增大而減小．這是由于溶液的堿性有助于解除細胞壁聚合物分子間的物理和化學作用，從而提高多糖產(chǎn)率，但過高的堿濃度會由于發(fā)生脫酯和消去反應而引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞［9］．選取NaOH 濃度為3．5 mol/mL 比較合適．

2．2．2 液料比對堿溶性多糖提取的影響 在其他條件同2．2．1 項一樣的情況下，分別取濃度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比10、15、20、25、30、35 mL/g 條件進行實驗．考察液料比對堿溶性多糖提取的影響，結(jié)果見圖3．

由圖3 可知，多糖百分含量隨著液料比的增加而增大，當液料比超過25 mL/g 時，多糖的得率呈下降趨勢．這是由于增大液料比可以使物料與溶劑接觸面積增大，使多糖被充分的提取出來，但液料比過大，也使其它成分被過多溶出［10］，這些成分可能會與多糖發(fā)生反應，從而導致多糖的提取降低． 因此最適液料比為25 mL/g．

2．2．3 加熱時間對堿溶性多糖提取的影響 在其他條件同2．2．2 項一樣的情況下，取濃度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比25 mL/g 分別加熱0．5、1、2、3、4、5 h 條件進行實驗．考察加熱時間對堿溶性多糖提取的影響，試驗結(jié)果見圖4．

圖3 液料比對多糖提取的影響Fig．3 Theinfluence of solvent－material ratio on polysaccharide extraction

圖4 加熱時間對多糖提取的影響Fig．4 The influence of heating time on polysaccharide extraction

由圖4 可知，多糖百分含量在隨著加熱時間的延長而增加．一直到5 h 處多糖百分含量隨著加熱時間的延長還有所增加．所以，為了節(jié)約時間和成本，確定多糖提取的加熱時間為5 h．

2．2．4 加熱溫度對堿溶性多糖提取的影響 在其他條件同2．2．3 項一樣的情況下，取濃度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比25 mL/g 加熱時間5 h，加熱溫度為60、70、80、90、100℃條件進行實驗．考察加熱溫度對堿溶性多糖提取的影響，結(jié)果見圖5．

由圖5 可知，隨著溫度的升高，多糖的提取得率逐漸升高，這說明溫度越高對歐李細胞的破壞作用越大，有利于多糖的浸出．但是，溫度太高，特別是在100℃左右時，歐李種殼提取液的多糖含量提取變得很少，這可能有兩種原因:一是由于在高溫下歐李細胞開始處于“崩潰”、溶解的狀態(tài);另外的可能是歐李中含有的多糖在100℃左右糊化，因此歐李提取液變成粘稠度很濃的狀態(tài)．這種高粘的液體對于固液分離是不利的，完全影響到歐李種殼堿溶性多糖的提?。虼思訜釡囟仍?0℃時提取出來的多糖百分含量相對最多．則最佳的加熱溫度應選取80℃．

圖5 加熱溫度對多糖提取的影響Fig．5 The influence of heating temperature on polysaccharide extraction

2．3 響應曲面法試驗結(jié)果

響應曲面法試驗后，各組的試驗結(jié)果見表3．

表3 響應曲面法試驗結(jié)果表Tab．3 The test results of response surface method

根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)，用Design Expert 工具對數(shù)據(jù)進行了分析，得到了響應曲面的方差分析表(見表4)．

表4 響應面二次模型方差分析表Tab．4 The anova table of response surface quadratic model

利用Design Expert 軟件對表4 中響應值進行二元回歸擬合，獲得多糖百分比含量預測值對編碼自變量加熱溫度、加熱時間、液料比和NaOH 濃度的二次多項回歸方程:

上式中，Y 為多糖百分比含量的預測值，A，B，C 和D 分別為加熱溫度，加熱時間，液料比和NaOH 濃度的編碼值．

2．4 響應曲面法優(yōu)化工藝

2．4．1 雙因素交互作用分析［11］回歸方程的方差分析結(jié)果見表4．由方差分析表可知，本試驗所建立的提取數(shù)學模型中AB、AD、BD 的交互影響較小，只有AC、BC、CD 的交互作用顯著，即加熱溫度和液料比之間的交互作用對堿溶性多糖提取率有顯著影響，加熱時間和液料比之間的交互作用對堿溶性多糖提取率有顯著影響，液料比和NaOH濃度之間的交互作用對堿溶性多糖提取率有顯著影響，它們交互作用響應曲面分別如圖6、圖7 和圖8．

圖6 加熱溫度和液料比交互作用影響Fig．6 The interaction effects of heating temperature and solvent－material ratio

圖7 加熱時間和液料比交互作用影響Fig．7 The interaction effects of heating time and solvent－material ratio

圖8 NaOH 濃度和液料比交互作用影響Fig．8 The interaction effects of NaOH concentration and solvent－material ratio

從圖6 可以看出，當加熱溫度一定時，液料比在22 至30 之間變化，堿溶性多糖的含量先是顯著增大，但到達一定值時，又開始慢慢減小;當液料比一定時，加熱溫度在80℃至90℃之間變化，堿溶性多糖的含量先是漸漸增大，但到達一定值時，又開始慢慢減?。畯膱D7 可以看出，加熱時間和液料比的交互作用影響與加熱溫度和液料比交互作用影響是非常相似的． 同樣，從圖8 也可以看出，NaOH 濃度和液料比的交互作用影響與加熱溫度和液料比交互作用影響是非常相似的．

2．4．2 各因素的影響程度分析 各因素的F 值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F(xiàn) 值越大，表明對試驗指標的影響越大，即重要性越大．從方差分析表可知:FA=30．73，F(xiàn)B=0．03，F(xiàn)C=4．15，F(xiàn)D=2．38，即各因素對堿溶性多糖提取率的影響程度大小順序為:加熱溫度﹥液料比﹥NaOH 濃度﹥加熱時間．

2．4．3 提取條件的優(yōu)化 由所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析，得出堿溶性多糖提取含量最高的參數(shù)條件為:液料比27．12 mL/g、浸提溫度90℃、浸提時間4．98 h、NaOH 濃度3．23 mol/L．此優(yōu)化工藝下堿溶性多糖百分含量的預測值為52．19%，驗證實驗中實際測得堿溶性多糖提取率為48．97%．

3 結(jié)論

響應曲面法提取歐李種殼的堿性多糖，根據(jù)單因素試驗分析，選擇了加熱時間、加熱溫度、液料比和NaOH 濃度為自變量，多糖百分含量為響應值，運用響應面法(RSM)建立了提取工藝條件多元二次模型，能有效預測工藝的多糖百分含量．得到優(yōu)化的提取工藝條件為:加熱溫度90℃，加熱時間4．98 h，液料比27．12 ml/g，NaOH 濃度3．23 mol/L．按此提取工藝，提取出來的多糖百分含量為48．97%．從歐李種殼中提取堿溶性多糖的工藝簡單，能在常規(guī)條件下進行，且提取的多糖含量較多．因此工業(yè)生產(chǎn)從歐李種殼中提取多糖很有經(jīng)濟價值．

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