張 立，李能蓮，舍雅莉，王雅莉，陳 麗，駱亞莉，胡樹名，楊扶德

(甘肅中醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥生藥三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

苦馬豆為豆科苦馬豆屬植物苦馬豆Swainsonia salsula Taubert.的帶根全草，具有補(bǔ)腎、固精、利水等功效，為甘肅、寧夏、青海等地民間常用藥，常被用來(lái)治療陽(yáng)痿、遺精、白帶及小便不利等，民間藥物名為“馬皮泡”“尿泡草”“鈴當(dāng)草”“羊卵泡”“紅苦豆子”。民間常用苦馬豆素(Swainsonine，SW)治療腎炎水腫、慢性肝炎、肝硬化腹水等，具有悠久的應(yīng)用歷史［1］?？囫R豆素具有很強(qiáng)的抗腫瘤、抗輻射及免疫增強(qiáng)活性，作為一種嶄新的抗腫瘤藥物，已引起了極大關(guān)注，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［2］?？囫R豆素是從苦馬豆中提取的吲哚茲定生物堿，分子結(jié)構(gòu)是吲哚茲定環(huán)的1，2，8 位上各有 1 個(gè)羥基，化學(xué)名為 1，2，8-三羥基八氫吲哚茲定，屬于醇類，又被命名為吲哚茲定三醇?？囫R豆素的提取是采用對(duì)樣本酸化、堿化后從小極性溶劑到大極性溶劑分別萃取，再經(jīng)離子交換柱或硅膠柱層析從中分離苦馬豆素［3］。這種方法提取周期長(zhǎng)、步驟繁瑣，有待于進(jìn)一步改進(jìn)。此外，也有人工合成苦馬豆素的報(bào)道［4］，但方法步驟過(guò)多、產(chǎn)率低、不適于批量生產(chǎn)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用3種不同工藝提取苦馬豆中總生物堿，并比較總生物堿得率，探索一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、可用于苦馬豆素批量生產(chǎn)的提取分離工藝，為苦馬豆素的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 藥品與試劑

苦馬豆 Swainsonia salsula Taubert.地上部分，2011年8月采集于甘肅省古浪縣張家灣，由甘肅中醫(yī)學(xué)院楊扶德教授提供并鑒定。自然干燥，粉碎，陰涼處保存?zhèn)溆谩?50，850，950 g/L乙醇及碘化鉍鉀試劑，均由利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司提供;化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 乙醇回流提取及總苦馬豆堿含量測(cè)定

此為第1種工藝。準(zhǔn)確稱取苦馬豆干草粉3份，各5 g;分別經(jīng)750，850，950 g/L乙醇回流提取3次，每次2 h;水浴揮去乙醇至浸膏;2 mol/L HCl溶解后過(guò)濾得酸水液;3 000 r/min離心15 min得上清液;棄去固體雜質(zhì);用氨水調(diào)水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次揮去正丁醇得總生物堿，稱質(zhì)量，測(cè)提取物含量。碘化鉍鉀試管反應(yīng)為陰性停止萃取。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.2 超聲提取及總苦馬豆堿含量測(cè)定

此為第2種工藝。準(zhǔn)確稱取苦馬豆干草粉4份，各5 g;分別用75 mL自來(lái)水浸泡苦馬豆草粉12 h;置于59 kHz超聲清洗器45℃，分別處理30，60，90，120 min，重復(fù)2 次，過(guò)濾得水液;水液置水浴鍋上80℃濃縮到30 mL后，用2 mol/L HCL酸化;3 000 r/min離心15 min得上清液;棄去固體雜質(zhì);用氨水調(diào)水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次后回收溶劑得總生物堿稱質(zhì)量，測(cè)提取物含量。碘化鉍鉀試管反應(yīng)為陰性停止萃取。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.3 水提取及總苦馬豆堿含量測(cè)定

此為第3種工藝。準(zhǔn)確稱取苦馬豆干草粉5 g;加75 mL自來(lái)水浸泡過(guò)夜;常壓下煮沸，每次1 h，共3次，過(guò)濾得水液;煮沸濃縮到15 mL;用2 mol/L HCl酸化過(guò)濾得酸水液;3 000 r/min離心15 min得上清液;棄去固體雜質(zhì);最后用氨水調(diào)水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次后回收溶劑得總生物堿稱質(zhì)量，測(cè)提取物含量。碘化鉍鉀試管反應(yīng)為陰性停止萃取。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3 結(jié)果

見表1～3。

表1 不同提取方法生物堿出膏率對(duì)比

表2 不同處理間方差分析

表3 不同處理間差異顯著性

通過(guò)表1～3結(jié)果分析:提取工藝1，2，3的總生物堿平均得率分別是6.641 9%、3.998 6%、1.311 6%。750 g/L乙醇回流提取總生物堿平均得率最高，與其他處理方法比較總生物堿平均得率差異顯著及極顯著(P＜0.01);850 g/L乙醇與超聲60 min、水煮處理間具有顯著差異(P＜0.05)。850 g/L乙醇提取的出膏率平行5次試驗(yàn)，差別較大，分析原因可能是工藝的可重復(fù)性較差，同時(shí)850 g/L乙醇提取的成分較為黏稠，對(duì)生物堿純化不利。

4 討論

苦馬豆Swainsonia salsula Taubert.為豆科苦馬豆屬植物，在我國(guó)其資源豐富，對(duì)其提取物苦馬豆素藥用價(jià)值的發(fā)掘和研究方興未艾。Colegate等［5］首次分離苦馬豆素是用熱乙酸乙酯索氏提取24 h，水溶部分上強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱，收集稀氨水洗脫部分，濃縮后的殘留物過(guò)藥用瓊脂糖凝膠柱，回收溶劑后重結(jié)晶，最后得到白色針狀結(jié)晶。葛鵬斌等［6］分別從莖直黃芪和小花棘豆中分離出苦馬豆素。童德文等［7］通過(guò)升華法和高效液相色譜從甘肅棘豆中分離得到苦馬豆素純品，得率為14.52μg/g。李勤凡等［8］采用萃取法改進(jìn)了甘肅棘豆中苦馬豆素提取工藝，但得率僅為5μg/g。上述方法提取周期長(zhǎng)、步驟繁瑣，實(shí)驗(yàn)成本高。

本次研究在條件相同的情況下，比較了乙醇回流、超聲處理法和水煮法3種提取工藝對(duì)苦馬豆中總生物堿得率的影響。水煮法在3種工藝中消耗成本最低，但苦馬豆素總堿得率最低，且它要求物質(zhì)的親水性和熱穩(wěn)定性高，在萃取的過(guò)程中乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，需要正丁醇萃取液長(zhǎng)時(shí)間加熱或靜置離心以消除乳化現(xiàn)象，不適于批量生產(chǎn)。用超聲提取中，將植物樣品經(jīng)水浸泡后采用超聲技術(shù)處理(30，60，90，120 min)［9-13］，但總堿得率較低，也不適于苦馬豆素總堿的批量生產(chǎn)。3種提取工藝中，乙醇回流提取中總堿平均得率高于其他兩種工藝，其中750 g/L%乙醇得率最高，周期短、易于操作，試驗(yàn)中的溶劑回收后可以重復(fù)利用，是目前提取苦馬豆素的一種最為簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的工藝。游離的生物堿及生物堿鹽都能溶于甲醇和乙醇，雖然甲醇的沸點(diǎn)低于乙醇且極性比乙醇大，對(duì)生物堿鹽類的溶解性強(qiáng)于乙醇，但甲醇對(duì)人體的毒害較大、價(jià)格高于乙醇，故本實(shí)驗(yàn)使用乙醇作為溶劑。乙醇質(zhì)量濃度設(shè)計(jì)在750～950 g/L，是因?yàn)榭囫R豆中生物堿種類較多，僅使用水或乙醇做溶劑不能完全提取，且苦馬豆為草本植物，材料的吸濕性比較強(qiáng)，所以選擇的物料比較大，在第一次浸提時(shí)加量較多。此與陳紹淑［13］、趙寶玉［14］的報(bào)道一致。在提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn):950 g/L乙醇提取的成分中所含色素多，測(cè)定生物堿之前需用石油醚除掉色素;850 g/L乙醇提取的成分較為黏稠，對(duì)生物堿純化不利;750 g/L乙醇提取的成分?jǐn)?shù)量較少，顏色淡。由此可見，如果需要色素可使用950 g/L乙醇做提取溶劑;如果節(jié)約成本，可使用750 g/L乙醇做提取溶劑。同時(shí)苦馬豆素為大極性生物堿，根據(jù)相似相溶的原理，本研究在提取過(guò)程中對(duì)植物樣品經(jīng)酸化、堿化處理后，直接使用了大極性的正丁醇對(duì)堿水液中生物堿進(jìn)行萃取，省去了常規(guī)先使用氯仿、乙酸乙酯等小中極性溶劑反復(fù)萃取的步驟。

［1］甘肅省衛(wèi)生局.甘肅中草藥手冊(cè)［M］.蘭州:甘肅人民出版社，1973:1512.

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