高曉蘭，朱增強(qiáng)

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，甘肅蘭州730000;2.蘭州石化總醫(yī)院腫瘤血液科，甘肅蘭州730060)

研究防止腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷的藥物，尋找有效的方法促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)元的功能恢復(fù)，一直是相關(guān)生命學(xué)科研究的重要課題。缺血性腦卒中的主要病理過(guò)程是腦部的缺血再灌注損傷。海馬區(qū)對(duì)缺血缺氧比較敏感，腦缺血再灌注損傷可造成海馬區(qū)錐體細(xì)胞遲發(fā)性壞死［1］。腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)特異性攜氧蛋白，與腦內(nèi)氧的運(yùn)輸、貯備和利用密切相關(guān)［2］。當(dāng)歸補(bǔ)血湯有補(bǔ)氣益血之功效，有研究表明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)心肌代謝，解除冠狀動(dòng)脈痙攣，減輕心肌的缺血性損傷［3］。有關(guān)加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷的作用和機(jī)制研究并不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)觀察了加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬各區(qū)NGB陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)和腦組織梗死體積的影響，以期從而探討加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

Wistar大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量22～280 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(甘)2011－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組方:黃芪100 g，黨參100 g，當(dāng)歸20 g。藥物均購(gòu)自蘭州德生堂大藥房，所有藥物先添加少量蒸餾水浸泡1 h，再分別加1 000 mL和500 mL蒸餾水煎煮2次，每次1 h，最后合并2次藥液，濾紙過(guò)濾、，浴鍋蒸發(fā)濃縮至濃度為1 g生藥/mL備用，使用時(shí)再加蒸餾水配制成所需濃度。200 g/L烏拉坦，上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào)110412;NGB多克隆抗體和相應(yīng)標(biāo)記二抗，購(gòu)自Santa Cruz公司;濃縮型SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)免疫組化染色試劑盒(批號(hào)201012)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(批號(hào) K12613B)以及 2，3，5－氮化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色試劑盒(批號(hào)F20080102)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心病理實(shí)驗(yàn)室提供。BI－2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司提供;AO－82型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，產(chǎn)地美國(guó);FA2004N型電子分析天平，上海精科天平廠產(chǎn)品;Olympus CH－212型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;臺(tái)式離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;PYX－PHS－B型隔水式電熱培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 模型的建立、分組與給藥

大鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，開(kāi)始以線栓法［4］制備腦缺血再灌注損傷模型。大鼠術(shù)前禁食8～12 h后，以200 g/L烏拉坦(750μg/g)腹腔注射麻醉，仰臥固定于固定架上，頸部皮膚備皮、消毒，正中稍左側(cè)切口，分離皮下組織，在胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌之間找到大血管，觸摸有搏動(dòng)感，即頸總動(dòng)脈。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，在距頸總動(dòng)脈分叉處1 cm位置結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈，同時(shí)動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈，提起左側(cè)頸外動(dòng)脈游離端使其與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線，于頸外動(dòng)脈結(jié)扎處近心端約0.5 cm位置剪一小切口，以左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，將一尼龍線經(jīng)左側(cè)頸外動(dòng)脈切口處緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈方向推進(jìn)，推進(jìn)18～20 mm感受到輕微阻力時(shí)即為阻斷了大腦中動(dòng)脈。阻斷2 h后，撥出尼龍線，扎緊動(dòng)脈殘端，縫合傷口，完成大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立。假手術(shù)對(duì)照組除不插線外，其他過(guò)程同上。60只實(shí)驗(yàn)大鼠中有15只或因手術(shù)麻醉、出血死亡、或不符合模型標(biāo)準(zhǔn)被棄。將余下45只隨機(jī)分為以下3組:假手術(shù)及生理鹽水灌胃對(duì)照組(A組)，局灶性腦缺血損傷再灌注及生理鹽水灌胃組(B組)，局灶性腦缺血再灌注損傷及加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯灌胃給藥組(C組)，每組15只。造模術(shù)后第2天起開(kāi)始給藥，C組大鼠以加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯10 mg生藥/g體質(zhì)量灌胃，A、B兩組大鼠以生理鹽水10μL/g體質(zhì)量灌胃，每天2次，連續(xù)2周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次給藥后將各組大鼠斷頭取腦，置于40 g/L多聚甲醛固定液中12 h，常規(guī)石蠟包埋，取兩耳極連線前6 mm左右冠狀切面，切片厚7μm，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 海馬各亞區(qū)及齒狀回NGB免疫反應(yīng)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

SABC免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，用1∶50過(guò)氧化氫－甲醇混合液(20 ℃)處理30 min，0.01 M PBS緩沖液漂洗3 次;將載玻片放入濕盒，滴加正常山羊血清封閉液，室溫(20℃)放置30 min，不洗;滴加NGB多克隆抗體，4℃冰箱過(guò)夜后，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;滴加兔抗大鼠IgG，室溫(20 ℃)孵育30 min，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;滴加SABC，室溫(20℃)孵育30 min，0.01 M PBS緩沖液洗滌3次;室溫下DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，以NGB陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色、背景為淡黃色為度，蒸餾水洗滌;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性塑膠封片后顯微鏡觀察大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回(dentate gyrus，DG)組織切片，取每張切片5個(gè)高倍視野，計(jì)算NGB免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 腦組織梗死體積

以TTC染色法檢測(cè)。將大鼠斷頭取腦速凍后，取視交叉后方連續(xù)2 mm腦組織冠狀切片，放置于20 g/L的TTC染液中;于37℃恒溫孵育15 min，梗死區(qū)腦組織呈現(xiàn)灰白色，而正常腦組織呈現(xiàn)鮮紅色;將顯色后的腦組織切片放置于40 g/L多聚甲醛緩沖液中固定24 h;分離出梗死區(qū)腦組織，電子天平稱質(zhì)量，然后以梗死區(qū)腦組織的質(zhì)量占缺血區(qū)腦組織質(zhì)量的百分比作為相對(duì)梗死體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)NGB免疫組化染色結(jié)果及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)比

免疫組化染色后，A組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞體及突起內(nèi)有棕黃色的NGB陽(yáng)性顆粒，排列整齊。B組大鼠海馬各區(qū)及齒狀回NGB陽(yáng)性細(xì)胞分布稀疏，數(shù)目較A組、C組明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 高倍鏡下各組大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回NGB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)比 個(gè)±s

表1 高倍鏡下各組大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回NGB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)比 個(gè)±s

注:與A組對(duì)比，*P＜0.05;與 B組對(duì)比，#P＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù)CA1 CA2 CA3 DG A 組 15 18.20 ±0.15 17.62.±1.06 17.93 ±1.15 14.16 ±2.61 B 組 15 11.31 ±0.411 10.85 ±1.13* 10.67 ±1.05* 9.01 ±0.29*C 組 15 15.63 ±0.162 14.41 ±1.52# 15.01 ±0.26# 12.81 ±0.35#

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積對(duì)比

C組較B組能在一定程度上減少大鼠腦缺血再灌注損傷后的腦組織梗死范圍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織梗死體積對(duì)比 ±s

表2 各組大鼠腦組織梗死體積對(duì)比 ±s

注:與B 組對(duì)比，#P ＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 腦組織梗死體積/%A組15 0.00 ±0.00 B 組 15 29.87 ± 1.32 C 組 15 20.50 ± 0.08#

3 討論

腦缺血再灌注損傷屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，病機(jī)為臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，腦脈閉阻。因此治療中風(fēng)的基本原則為補(bǔ)益氣血、行氣活血、疏通腦脈、滋養(yǎng)腦髓［5］，改善腦部缺血缺氧癥狀。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是中醫(yī)補(bǔ)氣生血代表方劑，方中重用黃芪大補(bǔ)脾氣，以資氣血生化之源，使氣旺血生;同時(shí)配以少量甘辛而溫的當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，則陽(yáng)生陰長(zhǎng)，脾運(yùn)得健，氣旺血生［6］;加味藥黨參亦具有較強(qiáng)的補(bǔ)氣益血功效。三藥配伍，扶正固本，標(biāo)本兼治。NGB與腦組織對(duì)氧的利用密切相關(guān)，增加腦內(nèi)NGB的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用［7］。目前認(rèn)為:大腦海馬區(qū)(尤其是CA1區(qū))是對(duì)缺血缺氧性損傷耐受性最差的區(qū)域［8］。研究發(fā)現(xiàn):NGB主要參與氧在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)與貯存，在神經(jīng)系統(tǒng)的氧攝取、運(yùn)輸和利用等過(guò)程中起著極其重要的作用，是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，在腦保護(hù)、改善神經(jīng)功能和預(yù)后等方面起著重要的作用［9］。缺血性腦損傷后遺癥的發(fā)生和神經(jīng)再生障礙相關(guān)。一直以來(lái)，人們普遍認(rèn)為受損的神經(jīng)細(xì)胞不能再生的主要原因是缺乏神經(jīng)保護(hù)因子等調(diào)節(jié)因素。Khan等［10］研究發(fā)現(xiàn):腦組織中NGB的表達(dá)增加可以降低轉(zhuǎn)基因小鼠的腦梗死體積，提示NGB在腦缺血缺氧性損傷中對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明:大鼠腦缺血再灌注損傷后NGB免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)數(shù)目顯著降低，而加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠增加大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)NGB陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)，同時(shí)一定程度上減少了腦缺血再灌注損傷后大鼠的腦組織梗死體積。此證明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯的配方選材及其對(duì)腦缺血再灌注損傷的療效是可以肯定的，但因腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)修復(fù)機(jī)制十分復(fù)雜，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯為中藥復(fù)方，故其對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制還有待做進(jìn)一步研究。

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